Détection rapide de l’antigène fécal de l’infection à Helicobacter pylori grâce à la technologie de détection à double sandwich d’anticorps

Résumé

Dans cette étude, une technique de détection sandwich basée sur des anticorps doubles a été développée pour la détection rapide des antigènes fécaux infectés par Helicobacter pylori.

Résumé

Helicobacter pylori peut être parasite de la muqueuse gastrique, ce qui peut provoquer une série de maladies gastro-intestinales après l’infection et est étroitement lié à la gastrite, à l’ulcère gastrique et au cancer gastrique. La forte prévalence de l’infection à H. pylori dans les régions où les infrastructures médicales et les zones d’assainissement sont insuffisantes reste un problème de santé publique important. Par conséquent, la mise au point de méthodes de dépistage rapides, simples et rentables pour la détection de H. pylori dans les milieux à ressources limitées est d’une importance capitale.

Dans cette étude, nous avons effectué un dépistage communautaire dans le village de Shitan, dans la province du Guangdong, une zone isolée et sous-développée caractérisée par une population permanente d’environ 300 résidents avec un faible niveau d’éducation. Nous avons utilisé un test sandwich à double anticorps pour la détection de l’antigène fécal de H. pylori , une méthode choisie pour son applicabilité potentielle dans les milieux à faibles ressources. Au total, 261 participants du village ont été recrutés et leurs échantillons de matières fécales ont été analysés à l’aide de cette technique. À des fins de validation comparative, les mêmes échantillons ont été soumis à une analyse quantitative de réaction en chaîne par polymérase (qPCR). Par rapport aux résultats de la qPCR, la sensibilité et la spécificité de la détection de l’antigène de H. pylori dans les fèces étaient de 60,24 % et 80,08 %. Les résultats ont démontré une forte concordance entre la méthode de détection de l’antigène fécal et la qPCR (Kappa = 0,630). Cette étude a systématiquement élucidé les principes, les procédures, les méthodologies et les applications cliniques de la détection des antigènes fécaux pour l’infection à H. pylori , dans le but d’explorer la technologie du sandwich à double anticorps à base de latex et d’établir de nouvelles stratégies et des directives pratiques pour son diagnostic auxiliaire.

Introduction

Helicobacter pylori (H. pylori, Hp) est une bactérie microaérophile, en forme de spirale et à Gram négatif¹. En raison de sa capacité à coloniser et à infecter de manière chronique l’estomac humain², cet agent pathogène a été identifié comme un facteur étiologique majeur dans le développement de l’adénocarcinome gastrique ^3,4. En 2015, ~4,4 milliards de personnes dans le monde souffraient d’une infection à H. pylori ⁵. La prévalence de l’infection à H. pylori présente des variations géographiques considérables, les pays en développement connaissant des taux nettement plus élevés que les pays développés. Notamment, dans les pays à faible revenu et parmi certaines populations vulnérables, le taux d’infection peut atteindre jusqu’à 75 %⁶.

Bien que les méthodes de détection traditionnelles telles que la gastroscopie soient précises, leur application dans le dépistage à grande échelle et le suivi de routine est limitée en raison de leur caractère invasif, de leur coût élevé et de leur faible acceptation par les patients⁷. Par conséquent, la recherche de méthodes de diagnostic non invasives, simples et rapides est devenue une direction importante de la recherche en médecine clinique moderne. L’objectif principal d’un diagnostic non invasif de H. pylori est de détecter avec précision, sécurité et commodité si le patient est infecté par H. pylori sans examen endoscopique. Le test respiratoire à l’urée (UBT), le test d’antigène fécal de H. pylori (FAT)⁸ et le test sérologique⁹ sont des techniques non invasives populaires.

Parmi celles-ci, l’UBT est la procédure la moins intrusive et la plus précise disponible¹⁰. La sensibilité et la spécificité de l’UBT sont supérieures à 95 %¹¹. Parmi les méthodes de diagnostic non invasives disponibles, l’UBT s’est avérée être la plus précise et la plus fiable, comme le montre une étude de validation menée en Irak, l’UBT peut être recommandée comme premier choix en raison de ses performances supérieures à celles des autres méthodes¹². Cependant, l’UBT présente également des inconvénients, tels que son coût élevé et la nécessité d’une analyse par spectrométrie de masse, ce qui limite l’application dans des environnements éloignés ou aux ressources limitées¹³.

La mise au point d’une méthode de diagnostic rapide, non invasive et rentable pour détecter l’infection à H. pylori est absolument nécessaire, en particulier dans les régions aux ressources limitées. Dans cette étude, nous avons développé une technologie de détection rapide de l’antigène fécal de H. pylori basée sur la technologie de détection en sandwich d’anticorps doubles, qui peut détecter l’antigène de H. pylori dans les échantillons fécaux rapidement, efficacement et à faible coût. Cette technologie offre des avantages significatifs, notamment son prix abordable, son caractère non invasif, sa facilité d’utilisation et sa capacité d’adaptation aux régions éloignées. Nous émettons l’hypothèse que la méthode sandwich à double anticorps pour détecter l’antigène fécal de H. pylori démontrera une sensibilité et une spécificité comparables à la qPCR, ce qui la positionne comme un outil viable pour le diagnostic clinique non invasif.

Nous avons détaillé en détail les principes, les procédures, les forces méthodologiques et l’applicabilité clinique de la détection des antigènes fécaux pour l’infection à H. pylori . Pour valider son caractère pratique, nous avons mené une enquête épidémiologique et un dépistage dans le village de Shitan, dans la ville de Qingyuan, dans la province du Guangdong, en Chine, qui est une région éloignée et sous-développée avec une population permanente d’environ 400 personnes et un niveau d’éducation limité. Nos résultats démontrent que la technologie de détection rapide de l’antigène de H. pylori dans les fèces conçue ici peut être réalisée en 20 min. Il est souligné que la détection rapide de l’antigène de H. pylori dans les matières fécales est un outil potentiel et prometteur pour le diagnostic rapide et fiable de l’infection à H. pylori dans les zones reculées et arriérées.

Protocole

Cette étude transversale a été approuvée par le comité d’éthique de l’hôpital populaire provincial du Guangdong (numéro d’approbation : KY2024-445-01), et les données personnelles de tous les sujets de l’étude ont été strictement confidentielles pendant l’étude. Tous les participants ont signé un consentement éclairé écrit avant les expériences. En 2024, les habitants du village de Shitan, dans la ville de Qingyuan, dans la province du Guangdong, ont été sélectionnés comme sujets de recherche, et il n’y avait aucune restriction d’âge et de sexe. Le test sandwich à double anticorps (une expérience qualitative) décrit ci-dessous a été effectué par du personnel médical et technique professionnel conformément aux instructions. L’ensemble de la population permanente du village a été sélectionnée pour cette étude, qu’elle soit en bonne santé ou qu’elle présente des symptômes ou des maladies existantes liées aux maladies gastro-intestinales.

1. Sélection des patients

1. Excluez les patients s’ils ont utilisé des inhibiteurs de la pompe à protons ou du bismuth, des antagonistes des récepteurs_H2 ou des antibiotiques au cours du mois précédent.
2. Demandez à tous les participants de remplir le questionnaire de manière anonyme. Le contenu du questionnaire comprend cinq questions : Prenez-vous trois repas régulièrement ? Buvez-vous de l’alcool ? Connaissez-vous H. pylori ? Pensez-vous qu’il est nécessaire d’effectuer une inspection de H. pylori ? Comprenez-vous les conséquences néfastes de l’infection à H. pylori ?

2. Procédure de détection de l’antigène de l’infection fécale à H. pylori

REMARQUE : L’algorithme de test de l’antigène des selles de H. pylori a été conçu pour assurer l’exactitude et la fiabilité des résultats, en tenant compte de la simplicité et de l’hygiène. L’ensemble du processus est divisé en cinq étapes : prélèvement d’échantillons, traitement des échantillons, stockage des échantillons, détection et interprétation des résultats. L’organigramme de travail et le schéma de principe de la détection d’échantillon sont illustrés aux figures 1 et 2.

1. Prélèvement d’échantillons
   REMARQUE : Des contenants spécifiques de l’antigène H. pylori doivent être utilisés pour le prélèvement des échantillons. Les échantillons ne doivent pas être mélangés avec de l’eau, de l’urine, des désinfectants et des eaux usées.
   1. Une fois la défécation terminée, retirez le couvercle supérieur du récipient spécial pour retirer la tige d’échantillonnage.
   2. Insérez la tige d’échantillonnage en continu dans cinq positions différentes du tabouret pour l’échantillonnage, en vous assurant que l’extrémité filetée de la tige d’échantillonnage est complètement insérée dans le tabouret.
   3. Réinsérez la tige d’échantillonnage dans le tube à réactif une fois l’échantillonnage terminé ; Le volume de l’échantillon est de ~5-50 mg au total.
2. Traitement des échantillons
   1. Agiter le tube de réactif d’un côté à l’autre pendant ~10 s pour bien mélanger l’échantillon de selles dans le diluant (ingrédients principaux : acide éthylènediamine tétraacétique hydraté de tétrasodium 0,018 g/mL et chlorure de sodium 0,01 g/mL).
3. Stockage des échantillons
   1. Tester les échantillons le plus tôt possible après l’échantillonnage ; les conserver à température ambiante pendant 6 h au plus et au réfrigérateur (pas plus de 72 h à 2-8 °C et pas plus de 6 mois congelés à -25 °C à -15 °C) si nécessaire pour ralentir la dégradation de l’antigène et l’activité microbienne.
      REMARQUE : Les échantillons peuvent être congelés et décongelés à plusieurs reprises jusqu’à 3 fois, et les échantillons réfrigérés et congelés doivent être remis à température ambiante avant d’être testés.
4. Détection d’échantillons
   1. Ouvrez le couvercle blanc du couvercle du tube de réactif et maintenez le tube de réactif en érection.
   2. Appuyez sur le couvercle jusqu’au point le plus bas pour que l’échantillon s’écoule sur la carte de test, en passant par la zone de détection (T) et la zone de contrôle de la qualité (C) recouvertes de l’anticorps anti-Hp de souris.
5. Interprétation des résultats
   1. Attendez 10 à 20 minutes pour que tout antigène de H. pylori dans l’échantillon, s’il est lié à l’anticorps, forme une réaction chromogène macroscopique dans la zone de détection. Il s’agit généralement d’une ligne rouge ou violette qui contraste avec la ligne dans la zone de contrôle de la qualité.
   2. La présence ou l’absence de la réaction de couleur et la profondeur de la couleur sont liées à la concentration de l’antigène de H. pylori dans l’échantillon. Comparez les cartes de couleurs pour interpréter rapidement et précisément les résultats (voir Figure 3).

3. Extraction de l’ADN

1. Placez une quantité appropriée d’excréments dans un tube à essai, ajoutez la solution PBS et mélangez soigneusement en secouant. Centrifuger le mélange à 12 000 × g pendant 5 à 10 min, puis prélever soigneusement 200 μL de surnageant pour une extraction ultérieure.
2. En fonction du nombre d’échantillons, préparer un nombre égal de tubes à centrifuger de 1,5 ml. Dans chaque tube, ajoutez séquentiellement 20 μL de protéinase K (20 mg/mL), 10 μL de billes magnétiques, 200 μL du surnageant de l’échantillon et 200 μL de tampon de lyse A. Bien mélanger en inversant les tubes, puis incuber dans un bain métallique à 55 °C pendant 10 min.
3. Une fois la pyrolyse terminée, placez le tube de centrifugation sur le cadre magnétique, laissez-le reposer et laissez l’adsorption se produire pendant 1 minute sur les billes. Une fois que le liquide dans le tube est complètement clarifié, jetez le surnageant et essayez d’éviter de déranger les billes magnétiques.
4. Retirez les tubes du support magnétique et placez-les sur un support de tube à centrifuger de 1,5 ml. À l’aide d’une pipette, ajoutez 500 μL de tampon de lavage E dans chaque tube, mélangez soigneusement pendant 1 min, puis remettez les tubes dans la grille magnétique. Laissez les tubes reposer pendant 1 min, jetez le surnageant après clarification et évitez d’aspirer les billes magnétiques.
5. Répétez le processus de lavage en ajoutant 500 μL de tampon de lavage W2 dans chaque tube. Mélangez bien pendant 1 min, placez les tubes sur la grille magnétique et laissez-les reposer pendant 1 min. Jetez soigneusement le surnageant une fois que la solution s’est clarifiée, en veillant à ce que les billes magnétiques ne soient pas dérangées.
6. Ajouter 100 μL d’éluant, mélanger et incuber à 55 °C pendant 5 min.
7. Placez les tubes sur la grille magnétique et laissez-les reposer pendant 2 min. Une fois la solution clarifiée, transférez soigneusement l’acide nucléique élué dans un nouveau tube à centrifuger, en évitant l’aspiration des billes magnétiques.
8. Évaluez la pureté de l’ADN extrait en mesurant l’absorbance à 260 nm (A₂₆₀) et 280 nm (A₂₈₀). Calculez le rapport A₂₆₀/A₂₈₀ , qui doit idéalement être supérieur à 1,8 pour un ADN de haute pureté.

4. qPCR pour la détection de H. pylori et de la résistance aux antibiotiques

REMARQUE : Nous avons effectué une qPCR pour la détection de l’infection à H. pylori en amplifiant le gène ureA . Tous les produits de contrôle de qualité négatif sont de l’eau stérile et purifiée. Le produit de contrôle de la qualité positif contenu dans le kit de détection des acides nucléiques de H. pylori est constitué de billes étalons de H. pylori inactivées (ATCC 43504). Un C_T ≤ 30 avec une courbe typique en forme de S est considéré comme positif.

1. En fonction du nombre d’échantillons à tester, sortez la préparation lyophilisée de H. pylori du kit, et essorez-la rapidement pour garder la poudre lyophilisée au fond du tube.
2. Ouvrez délicatement le couvercle de la préparation lyophilisée ; prélever l’acide nucléique de l’échantillon à tester ; ajouter 25 μL d’acide nucléique de l’échantillon dans la préparation lyophilisée ; et couvrez hermétiquement le tube.
3. Agitez et mélangez uniformément le réactif PCR pendant 8 à 10 s, puis faites-le tourner rapidement pendant 3 à 5 s.
4. Pour chaque échantillon sur une plaque de 32 puits, préparer 25 μL du mélange réactionnel PCR (poudre lyophilisée [contenant l’enzyme Taq (5 U/μL), le désoxyribonucléoside triphosphate (2,5 mmol/L), l’enzyme UNG (2 U/μL), l’ureA avant (5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3') et inverse (amorces 5'-CGCCCAATCTCTCACTTTATCG-3') (40 μmol/L)]), et 25 μL (2,5 μg) de l’ADN extrait.
5. Exécutez la carte qPCR à 32 puits sur la machine qPCR. Programmez le thermocycleur : 42 °C et 95 °C (tous deux pour un cycle) pendant 2 min chacun ; 95 °C pendant 10 s et 65 °C pendant 45 s (deux pas font un cycle) pendant 10x ; 95 °C pendant 10 s et à 58 °C pendant 45 s (deux pas représentent un cycle) pendant 35 cycles.
6. Analysez les données à l’aide d’un logiciel spécifique pour la qPCR et laissez l’instrument sélectionner automatiquement les seuils de référence.

5. Analyse statistique

1. Utilisez le test du chi carré pour analyser les données expérimentales afin d’évaluer la cohérence entre cette méthode et les résultats de la qPCR et comparez le taux positif de cette technologie de dépistage avec les données sur le taux positif d’infection à H. pylori à plus grande échelle (par exemple, à l’échelle nationale). Considérer les différences statistiquement significatives à P < 0,05.

Résultats

Enquête par questionnaire
Au total, 261 participants ont été inscrits à l’étude, dont 144 femmes et 117 hommes, âgés de 4 à 99 ans. L’âge moyen des sujets était de 48,30 ± 17,61 ans. Il y avait 17 mineurs (0-17 ans), 202 adultes (18-64 ans) et 42 participants âgés (>64 ans). Les résultats du questionnaire sont présentés dans le tableau 1. La majorité (90,8 %) des sujets pensaient qu’il était nécessaire d’effectuer un dépist...

Discussion

H. pylori représente l’une des infections bactériennes les plus répandues dans le monde¹⁵. Les résultats du questionnaire ont révélé que 55,2 % de la population ne connaissait pas H. pylori, tandis que 90,8 % pensaient que le dépistage de H. pylori était nécessaire. Ces résultats soulignent l’importance de mettre en œuvre des programmes de dépistage de H. pylori dans les zones économiquement défavorisées et ?...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA extraction kit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230223	None
H. pylori fecal antigen detection kit	Hangzhou nuohui healthy technology co., ltd	20213401126	None
H. pylori nucleic acid detection kit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230226	None
Real-time fluorescence quantitative PCR	Shanghai Hongshi medical treatment technology co., ltd	20183221659	None
Statistical Product and Service Solutions	IBM company	None	None