Helicobacter pylori Enfeksiyonunun Fekal Antijeninin Çift Antikor Sandviç Tespit Teknolojisine Dayalı Hızlı Tespiti

Özet

Bu çalışmada, Helicobacter pylori ile enfekte fekal antijenlerin hızlı tespiti için çift antikorlara dayalı bir sandviç tespit tekniği geliştirilmiştir.

Özet

Helicobacter pylori mide mukozasında parazit olabilir, bu da enfeksiyondan sonra bir dizi gastrointestinal hastalığa neden olabilir ve gastrit, mide ülseri ve mide kanseri ile yakından ilişkilidir. H . pylori enfeksiyonunun zayıf tıbbi altyapıya ve yetersiz sanitasyon alanlarına sahip bölgelerde yüksek prevalansı, önemli bir halk sağlığı sorunu olmaya devam etmektedir. Sonuç olarak, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda H. pylori tespiti için hızlı, basit ve uygun maliyetli tarama yöntemlerinin geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır.

Bu çalışmada, Guangdong Eyaleti, Shitan Köyü'nde, genellikle düşük eğitim düzeyine sahip yaklaşık 300 kişilik kalıcı bir nüfus ile karakterize edilen uzak ve az gelişmiş bir bölge olan toplum temelli bir tarama gerçekleştirdik. Düşük kaynak ortamlarında potansiyel uygulanabilirliği nedeniyle seçilen bir yöntem olan H. pylori fekal antijeninin tespiti için bir çift antikor sandviç testi kullandık. Köyden toplam 261 katılımcı kayıt altına alındı ve dışkı örnekleri bu teknik kullanılarak analiz edildi. Karşılaştırmalı doğrulama için, aynı numuneler kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizine tabi tutuldu. qPCR sonuçları ile karşılaştırıldığında, dışkıda H. pylori antijeninin saptanmasının duyarlılığı ve özgüllüğü %60.24 ve %80.08 idi. Sonuçlar, fekal antijen tespit yöntemi ile qPCR arasında güçlü bir uyum olduğunu gösterdi (Kappa = 0.630). Bu çalışma, H. pylori enfeksiyonu için fekal antijen tespitinin ilkelerini, prosedürlerini, metodolojilerini ve klinik uygulamalarını sistematik olarak açıklığa kavuşturmuş, lateks bazlı çift antikorlu sandviç teknolojisini keşfetmeyi ve yardımcı tanısı için yeni stratejiler ve pratik kılavuzlar oluşturmayı amaçlamıştır.

Giriş

Helicobacter pylori (H. pylori, Hp) mikroaerofilik, spiral şekilli, gram negatif bir bakteridir¹. İnsan midesini kolonize etme ve kronik olarak enfekte etme^{kabiliyeti nedeniyle 2}, bu patojen mide adenokarsinomunun^gelişiminde önemli bir etiyolojik faktör olarak tanımlanmıştır ^3,4. 2015 yılında dünyada ~ 4.4 milyar insan H. pylori enfeksiyonundan muzdaripti⁵. H. pylori enfeksiyonunun prevalansı, gelişmekte olan ülkelerin gelişmiş ülkelere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek oranlar yaşaması ile önemli ölçüde coğrafi farklılıklar göstermektedir. Özellikle, düşük gelirli ülkelerde ve belirli savunmasız nüfuslar arasında enfeksiyon oranı %75'e kadar ^{çıkabilmektedir6}.

Gastroskopi gibi geleneksel tanı yöntemleri her ne kadar doğru olsa da invaziv olmaları, maliyetlerinin yüksek olması ve hasta kabulünün düşük olması nedeniyle büyük ölçekli tarama ve rutin takiplerde uygulamaları sınırlıdır⁷. Bu nedenle, non-invaziv, basit ve hızlı tanı yöntemlerinin araştırılması, modern klinik tıp araştırmalarının önemli bir yönü haline gelmiştir. H. pylori'nin non-invaziv tanısının temel amacı, hastanın endoskopik inceleme olmadan H. pylori ile enfekte olup olmadığını doğru, güvenli ve rahat bir şekilde tespit etmektir. Üre nefes testi (UBT), H. pylori fekal antijen testi (FAT)⁸ ve serolojik test⁹ popüler noninvaziv tekniklerdir.

Bunlar arasında, UBT mevcut en az müdahaleci ve en doğru prosedürdür¹⁰. UBT'nin duyarlılığı ve özgüllüğü %95'in ^{üzerindedir11}. Mevcut non-invaziv tanı yöntemleri arasında UBT'nin en doğru ve güvenilir olduğu gösterilmiştir, Irak'ta yapılan bir validasyon çalışmasında görüldüğü gibi UBT, diğer yöntemlere göre daha yüksek performansı nedeniyle ilk seçenek olarak önerilebilir¹². Bununla birlikte, UBT'nin yüksek maliyeti ve kütle spektrometrik analiz ihtiyacı gibi dezavantajları da vardır, bu da uygulamayı uzak veya kaynak sınırlı ortamlarda sınırlar¹³.

H. pylori enfeksiyonunu tespit etmek için hızlı, invaziv olmayan ve uygun maliyetli bir tanı yönteminin geliştirilmesi, özellikle kaynakların sınırlı olduğu bölgelerde kritik öneme sahiptir. Bu çalışmada, dışkı örneklerinde H. pylori antijenini hızlı, etkili ve düşük maliyetle tespit edebilen çift antikor sandviç tespit teknolojisine dayalı H. pylori fekal antijeni için hızlı bir tespit teknolojisi geliştirdik. Bu teknoloji, satın alınabilirlik, non-invaziv olma, kullanıcı dostu olma ve uzak bölgelere uyarlanabilirlik dahil olmak üzere önemli avantajlar sunar. H. pylori fekal antijeni tespit etmek için çift antikor sandviç yönteminin, qPCR ile karşılaştırılabilir duyarlılık ve özgüllük göstereceğini ve onu non-invaziv klinik tanı için uygun bir araç olarak konumlandıracağını varsayıyoruz.

H. pylori enfeksiyonu için fekal antijen tespitinin ilkelerini, prosedürlerini, metodolojik gücünü ve klinik uygulanabilirliğini kapsamlı bir şekilde detaylandırdık. Pratikliğini doğrulamak için, Çin'in Guangdong Eyaleti, Qingyuan Şehri, Shitan Köyü'nde, yaklaşık 400 kalıcı nüfusu ve sınırlı eğitim kazanımı ile uzak ve az gelişmiş bir bölge olan epidemiyolojik bir araştırma ve tarama gerçekleştirdik. Sonuçlarımız, burada tasarlanan dışkıda H. pylori antijeninin hızlı tespit teknolojisinin 20 dakika içinde tamamlanabileceğini göstermektedir. Dışkıda H. pylori antijeninin hızlı tespitinin, uzak ve geri kalmış bölgelerde H. pylori enfeksiyonunun hızlı ve güvenilir teşhisi için potansiyel ve umut verici bir araç olduğu vurgulanmaktadır.

Protokol

Bu kesitsel çalışma, Guangdong İl Halk Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay Numarası: KY2024-445-01) ve çalışma sırasında tüm çalışma deneklerinin kişisel verileri kesinlikle gizli tutulmuştur. Tüm katılımcılar deneylerden önce yazılı bilgilendirilmiş onam imzaladılar. 2024 yılında Guangdong Eyaleti, Qingyuan Şehrindeki Shitan köyünün sakinleri araştırma konusu olarak seçildi ve yaş ve cinsiyet konusunda herhangi bir kısıtlama yapılmadı. Aşağıda açıklanan çift antikorlu sandviç testi (kalitatif bir deney), talimatlara göre profesyonel tıbbi ve teknik personel tarafından gerçekleştirilmiştir. Köyün tüm daimi nüfusu, sağlıklı olup olmadıklarına veya gastrointestinal hastalıklarla ilgili semptomları olup olmadığına veya mevcut herhangi bir hastalığı olup olmadığına bakılmaksızın bu çalışma için seçildi.

1. Hasta seçimi

1. Son 1 ay içinde proton pompa inhibitörleri veya bizmut, H₂ reseptör blokerleri veya antibiyotik kullanmış olan hastaları hariç tutun.
2. Tüm katılımcılardan anketi anonim olarak doldurmalarını isteyin. Anketin içeriği beş soru içermektedir: Düzenli olarak üç öğün yemek yiyor musunuz? Alkol içer misin? H. pylori'nin farkında mısınız? H. pylori muayenesi yapmanın gerekli olduğunu düşünüyor musunuz? H. pylori enfeksiyonunun olumsuz sonuçlarını anlıyor musunuz?

2. Fekal H. pylori enfeksiyonu antijen tespiti için prosedür

NOT: H. pylori dışkı antijen testi algoritması, basitlik ve hijyen göz önünde bulundurularak sonuçların doğruluğunu ve güvenilirliğini sağlamak için tasarlanmıştır. Tüm süreç beş adıma ayrılmıştır: numune toplama, numune işleme, numune saklama, algılama ve sonuç yorumlama. Numune tespitinin çalışma akış şeması ve şematik diyagramı Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmektedir.

1. Numune toplama
   NOT: Örnek toplama için H. pylori antijenine özgü kaplar kullanılmalıdır. Numuneler su, idrar, dezenfektan ve kanalizasyon ile karıştırılmamalıdır.
   1. Dışkılama tamamlandıktan sonra, örnekleme çubuğunu çıkarmak için özel kabın üst kapağını çıkarın.
   2. Numune alma çubuğunu, numune alma için taburenin beş farklı konumuna sürekli olarak yerleştirin ve numune alma çubuğunun dişli ucunun tabureye tamamen yerleştirildiğinden emin olun.
   3. Numune alma tamamlandıktan sonra numune alma çubuğunu tekrar reaktif tüpüne yerleştirin; Numune hacmi toplamda ~ 5-50 mg'dır.
2. Numune işleme
   1. Dışkı örneğini seyrelticide iyice karıştırmak için reaktif tüpünü ~10 saniye boyunca bir yandan diğer yana sallayın (ana bileşenler: etilendiamin tetraasetik asit tetrasodyum hidrat 0.018 g/mL ve sodyum klorür 0.01 g/mL).
3. Numune depolama
   1. Numune alındıktan sonra numuneleri mümkün olan en kısa sürede test edin; Antijen bozunmasını ve mikrobiyal aktiviteyi yavaşlatmak için gerekirse oda sıcaklığında en fazla 6 saat ve soğutulmuş koşullarda (2-8 °C'de en fazla 72 saat ve -25 °C ila -15 °C'de en fazla 6 ay dondurulmuş) saklayın.
      NOT: Numuneler tekrar tekrar dondurulabilir ve 3 kata kadar çözülebilir ve hem soğutulmuş hem de donmuş numuneler testten önce oda sıcaklığına geri döndürülmelidir.
4. Numune tespiti
   1. Reaktif tüpü kapağındaki beyaz kapağı açın ve reaktif tüpünü dik tutun.
   2. Numunenin test kartı üzerinde akması, algılama alanından (T) ve fare anti-Hp antikoru ile kaplanmış kalite kontrol alanından (C) geçmesi için kapağı en alt noktaya kadar bastırın.
5. Sonuçların yorumlanması
   1. Numunedeki herhangi bir H. pylori antijeni, antikora bağlanırsa, tespit alanında makroskopik bir kromojenik reaksiyon oluşturması için 10-20 dakika bekleyin. Bu genellikle kalite kontrol alanındaki çizgiyle kontrast oluşturan kırmızı veya mor bir çizgi olarak görünür.
   2. Renk reaksiyonunun varlığı veya yokluğu ve rengin derinliği, numunedeki H. pylori antijeninin konsantrasyonu ile ilgilidir. Sonuçları hızlı ve doğru bir şekilde yorumlamak için renk kartlarını karşılaştırın (bkz. Şekil 3).

3. DNA ekstraksiyonu

1. Bir test tüpüne uygun miktarda dışkı koyun, PBS çözeltisi ekleyin ve çalkalayarak iyice karıştırın. Karışımı 12.000 × g'da 5-10 dakika santrifüjleyin, ardından daha fazla ekstraksiyon için 200 μL süpernatanı dikkatlice toplayın.
2. Numune sayısına bağlı olarak, eşit sayıda 1,5 mL santrifüj tüpü hazırlayın. Her tüpe sırayla 20 μL proteinaz K (20 mg / mL), 10 μL manyetik boncuk, 200 μL numune süpernatanı ve 200 μL lizis tamponu A ekleyin. Tüpleri ters çevirerek iyice karıştırın, ardından 55 ° C'de 10 dakika boyunca metal bir banyoda inkübe edin.
3. Piroliz tamamlandıktan sonra, santrifüj tüpünü manyetik çerçeveye yerleştirin, bekletin ve boncuklar üzerinde 1 dakika adsorpsiyonun gerçekleşmesine izin verin. Tüpteki sıvı tamamen berraklaştırıldıktan sonra, süpernatanı atın ve manyetik boncukları rahatsız etmekten kaçının.
4. Tüpleri manyetik raftan çıkarın ve 1.5 mL'lik bir santrifüj tüpü rafına yerleştirin. Bir pipet kullanarak, her tüpe 500 μL yıkama tamponu E ekleyin, 1 dakika boyunca iyice karıştırın, ardından tüpleri manyetik rafa geri koyun. Tüplerin 1 dakika beklemesine izin verin, netleştirmeden sonra süpernatanı atın ve manyetik boncukları aspire etmekten kaçının.
5. Her tüpe 500 μL yıkama tamponu W2 ekleyerek yıkama işlemini tekrarlayın. 1 dakika boyunca iyice karıştırın, tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve 1 dakika bekletin. Çözelti berraklaştıktan sonra süpernatanı dikkatlice atın ve manyetik boncukların bozulmadığından emin olun.
6. 100 μL eluent ekleyin, karıştırın ve 55 °C'de 5 dakika inkübe edin.
7. Tüpleri manyetik rafa yerleştirin ve 2 dakika bekletin. Çözelti berraklaştıktan sonra, ayrıştırılmış nükleik asidi, manyetik boncukların aspirasyonunu önleyerek dikkatlice yeni bir santrifüj tüpüne aktarın.
8. 260 nm (A₂₆₀) ve 280 nm'de (A₂₈₀) absorbansı ölçerek ekstrakte edilen DNA'nın saflığını değerlendirin. Yüksek saflıkta DNA için ideal olarak 1.8'den büyük olması gereken A₂₆₀/A₂₈₀ oranını hesaplayın.

4. H. pylori'nin tespiti ve antibiyotiklere direnç için qPCR

NOT: Üre genini çoğaltarak H. pylori enfeksiyonunun tespiti için qPCR gerçekleştirdik. Tüm negatif kalite kontrol ürünleri steril, arıtılmış sudur. H. pylori nükleik asit tespit kitindeki pozitif kalite kontrol ürünü, H. pylori standart boncukları (ATCC 43504) inaktive edilmiştir. Tipik bir S şeklinde eğriye sahip A C_T ≤ 30 pozitif olarak kabul edilir.

1. Test edilecek numune sayısına göre, H. pylori dondurularak kurutulmuş preparatörü kitten çıkarın ve dondurularak kurutulmuş tozu tüpün dibinde tutmak için hızlı bir şekilde döndürün.
2. Dondurularak kurutulmuş preparatın kapağını dikkatlice açın; test edilecek numunenin nükleik asidini alın; dondurularak kurutulmuş preparasyona 25 μL numune nükleik asit ekleyin; ve tüpü sıkıca kapatın.
3. PCR reaktifini 8-10 saniye boyunca eşit şekilde çalkalayın ve karıştırın ve ardından 3-5 saniye boyunca hızlı bir şekilde döndürün.
4. 32 oyuklu bir plaka üzerindeki her numune için, 25 μL PCR reaksiyon karışımı (dondurularak kurutulmuş toz [Taq enzimi (5 U/μL), deoksiribonükleozit trifosfat (2.5 mmol/L), UNG enzimi (2 U/μL), ureA ileri (5'-ACATTGCGAGCGGGACAG-3') ve geri (5'-CGCCCAATCTCACTTTATCG-3') primerleri (40 μmol/L)]) ve ekstrakte edilen DNA'nın 25 μL'si (2.5 μg) hazırlayın.
5. 32 oyuklu plakalı qPCR kartını qPCR makinesinde çalıştırın. Termal döngüleyiciyi programlayın: 42 °C ve 95 °C (her ikisi de bir döngü için) her biri 2 dakika; 10x için 10 sn için 95 °C ve 45 sn için 65 °C (iki adım bir döngüdür); 10 saniye boyunca 95 °C ve 35 döngü için 45 saniye boyunca 58 °C'de (iki adım bir döngüdür).
6. qPCR için özel bir yazılım kullanarak verileri analiz edin ve cihazın temel eşikleri otomatik olarak seçmesine izin verin.

5. İstatistiksel analiz

1. Bu yöntem ile qPCR sonuçları arasındaki tutarlılığı değerlendirmek için deneysel verileri analiz etmek için ki-kare testini kullanın ve bu teknoloji taramasının pozitif oranını daha geniş bir ölçekte (örneğin, ülke çapında) H . pylori enfeksiyonunun pozitif oran verileriyle karşılaştırın. P < 0.05'te istatistiksel olarak anlamlı farklılıkları düşünün.

Sonuçlar

Anket anketi
Çalışmaya, yaşları 261 ile 144 arasında değişen 117 kadın ve 4 erkekten oluşan toplam 99 katılımcı dahil edildi. Olguların yaş ortalaması 48.30 ± 17.61 yıl idi. 17 çocuk (0-17 yaş), 202 yetişkin (18-64 yaş) ve 42 yaşlı katılımcı (>64 yaş) vardı. Anket sonuçları Tablo 1'de gösterilmiştir. Olguların çoğunluğu (%90.8) H. pylori taramasının yapılmasının gerekli olduğunu düşünmüştür.

Tartışmalar

H. pylori, tüm dünyada en yaygın bakteriyel enfeksiyonlardan birini temsil eder¹⁵. Anket sonuçları, toplumun %55.2'sinin H. pylori farkındalığının olmadığını, %90.8'inin ise H. pylori taramasının gerekli olduğuna inandığını ortaya koydu. Bu bulgular, ekonomik olarak dezavantajlı ve uzak bölgelerde H. pylori tarama programlarının uygulanmasının önemini vurgulamaktadır¹⁶. Üre n...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
DNA extraction kit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230223	None
H. pylori fecal antigen detection kit	Hangzhou nuohui healthy technology co., ltd	20213401126	None
H. pylori nucleic acid detection kit	Jiangsu mole biotechnology co., ltd	20230226	None
Real-time fluorescence quantitative PCR	Shanghai Hongshi medical treatment technology co., ltd	20183221659	None
Statistical Product and Service Solutions	IBM company	None	None