Method Article
Bu çalışmada, Helicobacter pylori ile enfekte fekal antijenlerin hızlı tespiti için çift antikorlara dayalı bir sandviç tespit tekniği geliştirilmiştir.
Helicobacter pylori mide mukozasında parazit olabilir, bu da enfeksiyondan sonra bir dizi gastrointestinal hastalığa neden olabilir ve gastrit, mide ülseri ve mide kanseri ile yakından ilişkilidir. H . pylori enfeksiyonunun zayıf tıbbi altyapıya ve yetersiz sanitasyon alanlarına sahip bölgelerde yüksek prevalansı, önemli bir halk sağlığı sorunu olmaya devam etmektedir. Sonuç olarak, kaynakların sınırlı olduğu ortamlarda H. pylori tespiti için hızlı, basit ve uygun maliyetli tarama yöntemlerinin geliştirilmesi büyük önem taşımaktadır.
Bu çalışmada, Guangdong Eyaleti, Shitan Köyü'nde, genellikle düşük eğitim düzeyine sahip yaklaşık 300 kişilik kalıcı bir nüfus ile karakterize edilen uzak ve az gelişmiş bir bölge olan toplum temelli bir tarama gerçekleştirdik. Düşük kaynak ortamlarında potansiyel uygulanabilirliği nedeniyle seçilen bir yöntem olan H. pylori fekal antijeninin tespiti için bir çift antikor sandviç testi kullandık. Köyden toplam 261 katılımcı kayıt altına alındı ve dışkı örnekleri bu teknik kullanılarak analiz edildi. Karşılaştırmalı doğrulama için, aynı numuneler kantitatif polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizine tabi tutuldu. qPCR sonuçları ile karşılaştırıldığında, dışkıda H. pylori antijeninin saptanmasının duyarlılığı ve özgüllüğü %60.24 ve %80.08 idi. Sonuçlar, fekal antijen tespit yöntemi ile qPCR arasında güçlü bir uyum olduğunu gösterdi (Kappa = 0.630). Bu çalışma, H. pylori enfeksiyonu için fekal antijen tespitinin ilkelerini, prosedürlerini, metodolojilerini ve klinik uygulamalarını sistematik olarak açıklığa kavuşturmuş, lateks bazlı çift antikorlu sandviç teknolojisini keşfetmeyi ve yardımcı tanısı için yeni stratejiler ve pratik kılavuzlar oluşturmayı amaçlamıştır.
Helicobacter pylori (H. pylori, Hp) mikroaerofilik, spiral şekilli, gram negatif bir bakteridir1. İnsan midesini kolonize etme ve kronik olarak enfekte etmekabiliyeti nedeniyle 2, bu patojen mide adenokarsinomunungelişiminde önemli bir etiyolojik faktör olarak tanımlanmıştır 3,4. 2015 yılında dünyada ~ 4.4 milyar insan H. pylori enfeksiyonundan muzdaripti5. H. pylori enfeksiyonunun prevalansı, gelişmekte olan ülkelerin gelişmiş ülkelere kıyasla önemli ölçüde daha yüksek oranlar yaşaması ile önemli ölçüde coğrafi farklılıklar göstermektedir. Özellikle, düşük gelirli ülkelerde ve belirli savunmasız nüfuslar arasında enfeksiyon oranı %75'e kadar çıkabilmektedir6.
Gastroskopi gibi geleneksel tanı yöntemleri her ne kadar doğru olsa da invaziv olmaları, maliyetlerinin yüksek olması ve hasta kabulünün düşük olması nedeniyle büyük ölçekli tarama ve rutin takiplerde uygulamaları sınırlıdır7. Bu nedenle, non-invaziv, basit ve hızlı tanı yöntemlerinin araştırılması, modern klinik tıp araştırmalarının önemli bir yönü haline gelmiştir. H. pylori'nin non-invaziv tanısının temel amacı, hastanın endoskopik inceleme olmadan H. pylori ile enfekte olup olmadığını doğru, güvenli ve rahat bir şekilde tespit etmektir. Üre nefes testi (UBT), H. pylori fekal antijen testi (FAT)8 ve serolojik test9 popüler noninvaziv tekniklerdir.
Bunlar arasında, UBT mevcut en az müdahaleci ve en doğru prosedürdür10. UBT'nin duyarlılığı ve özgüllüğü %95'in üzerindedir11. Mevcut non-invaziv tanı yöntemleri arasında UBT'nin en doğru ve güvenilir olduğu gösterilmiştir, Irak'ta yapılan bir validasyon çalışmasında görüldüğü gibi UBT, diğer yöntemlere göre daha yüksek performansı nedeniyle ilk seçenek olarak önerilebilir12. Bununla birlikte, UBT'nin yüksek maliyeti ve kütle spektrometrik analiz ihtiyacı gibi dezavantajları da vardır, bu da uygulamayı uzak veya kaynak sınırlı ortamlarda sınırlar13.
H. pylori enfeksiyonunu tespit etmek için hızlı, invaziv olmayan ve uygun maliyetli bir tanı yönteminin geliştirilmesi, özellikle kaynakların sınırlı olduğu bölgelerde kritik öneme sahiptir. Bu çalışmada, dışkı örneklerinde H. pylori antijenini hızlı, etkili ve düşük maliyetle tespit edebilen çift antikor sandviç tespit teknolojisine dayalı H. pylori fekal antijeni için hızlı bir tespit teknolojisi geliştirdik. Bu teknoloji, satın alınabilirlik, non-invaziv olma, kullanıcı dostu olma ve uzak bölgelere uyarlanabilirlik dahil olmak üzere önemli avantajlar sunar. H. pylori fekal antijeni tespit etmek için çift antikor sandviç yönteminin, qPCR ile karşılaştırılabilir duyarlılık ve özgüllük göstereceğini ve onu non-invaziv klinik tanı için uygun bir araç olarak konumlandıracağını varsayıyoruz.
H. pylori enfeksiyonu için fekal antijen tespitinin ilkelerini, prosedürlerini, metodolojik gücünü ve klinik uygulanabilirliğini kapsamlı bir şekilde detaylandırdık. Pratikliğini doğrulamak için, Çin'in Guangdong Eyaleti, Qingyuan Şehri, Shitan Köyü'nde, yaklaşık 400 kalıcı nüfusu ve sınırlı eğitim kazanımı ile uzak ve az gelişmiş bir bölge olan epidemiyolojik bir araştırma ve tarama gerçekleştirdik. Sonuçlarımız, burada tasarlanan dışkıda H. pylori antijeninin hızlı tespit teknolojisinin 20 dakika içinde tamamlanabileceğini göstermektedir. Dışkıda H. pylori antijeninin hızlı tespitinin, uzak ve geri kalmış bölgelerde H. pylori enfeksiyonunun hızlı ve güvenilir teşhisi için potansiyel ve umut verici bir araç olduğu vurgulanmaktadır.
Bu kesitsel çalışma, Guangdong İl Halk Hastanesi Etik Kurulu tarafından onaylanmıştır (Onay Numarası: KY2024-445-01) ve çalışma sırasında tüm çalışma deneklerinin kişisel verileri kesinlikle gizli tutulmuştur. Tüm katılımcılar deneylerden önce yazılı bilgilendirilmiş onam imzaladılar. 2024 yılında Guangdong Eyaleti, Qingyuan Şehrindeki Shitan köyünün sakinleri araştırma konusu olarak seçildi ve yaş ve cinsiyet konusunda herhangi bir kısıtlama yapılmadı. Aşağıda açıklanan çift antikorlu sandviç testi (kalitatif bir deney), talimatlara göre profesyonel tıbbi ve teknik personel tarafından gerçekleştirilmiştir. Köyün tüm daimi nüfusu, sağlıklı olup olmadıklarına veya gastrointestinal hastalıklarla ilgili semptomları olup olmadığına veya mevcut herhangi bir hastalığı olup olmadığına bakılmaksızın bu çalışma için seçildi.
1. Hasta seçimi
2. Fekal H. pylori enfeksiyonu antijen tespiti için prosedür
NOT: H. pylori dışkı antijen testi algoritması, basitlik ve hijyen göz önünde bulundurularak sonuçların doğruluğunu ve güvenilirliğini sağlamak için tasarlanmıştır. Tüm süreç beş adıma ayrılmıştır: numune toplama, numune işleme, numune saklama, algılama ve sonuç yorumlama. Numune tespitinin çalışma akış şeması ve şematik diyagramı Şekil 1 ve Şekil 2'de gösterilmektedir.
3. DNA ekstraksiyonu
4. H. pylori'nin tespiti ve antibiyotiklere direnç için qPCR
NOT: Üre genini çoğaltarak H. pylori enfeksiyonunun tespiti için qPCR gerçekleştirdik. Tüm negatif kalite kontrol ürünleri steril, arıtılmış sudur. H. pylori nükleik asit tespit kitindeki pozitif kalite kontrol ürünü, H. pylori standart boncukları (ATCC 43504) inaktive edilmiştir. Tipik bir S şeklinde eğriye sahip A CT ≤ 30 pozitif olarak kabul edilir.
5. İstatistiksel analiz
Anket anketi
Çalışmaya, yaşları 261 ile 144 arasında değişen 117 kadın ve 4 erkekten oluşan toplam 99 katılımcı dahil edildi. Olguların yaş ortalaması 48.30 ± 17.61 yıl idi. 17 çocuk (0-17 yaş), 202 yetişkin (18-64 yaş) ve 42 yaşlı katılımcı (>64 yaş) vardı. Anket sonuçları Tablo 1'de gösterilmiştir. Olguların çoğunluğu (%90.8) H. pylori taramasının yapılmasının gerekli olduğunu düşünmüştür.
Bu köyde fekal H. pylori antijeni tespitinin tarama sonuçları
Fekal H. pylori antijeni için test edilen 261 katılımcının 52'si (%19.92) pozitif, 209'u negatifti. 52 pozitif vakanın 32'si kadındı ve tüm kadın katılımcıların% 22.22'sini temsil ediyordu ve 20'si erkekti ve tüm erkek katılımcıların% 17.09'unu oluşturuyordu. Yaşa göre sınıflandırıldığında pozitiflik oranları şöyleydi: küçüklerde (0-17 yaş) 2 pozitif olgu (%11.76), yetişkinlerde (18-64 yaş) 41 pozitif olgu (%20.30) ve yaşlılarda (%>64 yaş) 9 pozitif olgu (%21.43).
Fekal H. pylori antijeni ile qPCR sonuçları arasındaki tutarlılığın karşılaştırılması
Bu çalışmada, deneysel protokolün güvenilirliğini karakterize etmek için farklı qPCR test sonuçlarına sahip iki örnek seçilmiştir (Şekil 4). 261 deneğin fekal H. pylori antijen sonuçları arasında 52'si pozitif, 209'u negatifti. 261 deneğin dışkısı ile yapılan qPCR sonuçlarından 83'ü pozitif, 178'i negatifti (Tablo 2). Fekal H. pylori antijen tespitinin duyarlılığı ve özgüllüğü sırasıyla %60.24 ve %80.08 idi. Bu yöntemin pozitif prediktif değeri (PPD) %96.15, negatif prediktif değeri (NPD) %84.21 idi. Kappa tutarlılık testi, iki yöntemin tanı sonuçlarının tutarlı olduğunu gösterir (Kappa = 0.630, P < 0.05).
Bu doğal köy ile tüm ülke arasındaki tarama pozitif oranının karşılaştırılması
Pozitiflik oranı %19,92 olup, ulusal pozitif oran olan %42,8'den biraz daha düşüktü14 (Tablo 3). Ki-kare testine göre (P < 0.01) pozitif oranlardaki fark istatistiksel olarak anlamlıydı.
Şekil 1: Numune tespitinin akış şeması. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Numune toplama ve algılamanın şematik diyagramı. Algılama cihazını çıkarın, alüminyum folyo torbayı yırtın ve reaktif tüpünü çıkarın. Turuncu tüp kapağını çıkarın ve dışkının farklı konumlarından 5 kat numune almak için numune alma çubuğunu kullanın. Örnekleme çubuğunu reaktif tüpüne geri yerleştirin ve tamamen karışması için 10 saniye boyunca sola ve sağa sallayın. Beyaz limit bloğunu kırın, reaktif tüpünü dik tutun ve zamanlamayı başlatmak için tüp kapağını en düşük konuma bastırın. Kırmızı bantların görünümünü gözlemleyin. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: Antijen sonuçlarının yorumlanması. (A) Örnekleyici. (B,E) Negatif (-): Negatif bir sonuç, numunede H. pylori antijeni tespit edilmediğini gösterir, bu da H. pylori enfeksiyonu riskinin düşük olduğunu düşündürür. Olumsuz bir sonuç, enfeksiyon olasılığını tamamen ortadan kaldıramaz. (C,F) Pozitif (+): Pozitif bir sonuç, örnekte H. pylori antijeninin tespit edildiği, H. pylori enfeksiyonundan şüphelenildiği anlamına gelir. (D) Etki yok: Geçersiz sonuçlar, numune toplama veya işleme süreciyle ilgili bir sorun olabilir veya reaktif bozulmuş ve hasar görmüş olabilir ve numune tekrar toplanmalı veya işlem adımları tekrarlanmalıdır. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: qPCR yöntemi ile dışkıda H. pylori tespiti. (S1) H. pylori enfeksiyonunun kantitatif PCR amplifikasyonunun negatif sonucu. (S2) H. pylori enfeksiyonunun kantitatif PCR amplifikasyonunun pozitif sonucu. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: H. pylori ile enfekte fekte fekal antijeni tespit etmek için çift antikor sandviç yönteminin şematik diyagramı. Fare anti-Hp antikoru (VacA epitopu) önceden zar üzerindeki tespit alanına (T) sabitlendi. Kalite kontrol alanı (C) keçi anti-fare IgG ve streptavidin önceden düzeltir. Polyester film, lateks etiketli fare anti-Hp antikoru ve lateks-BSA-biotin konjugatı ile kaplandı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Üç öğün düzenli olarak yemek yiyip yememeli? | Alkol içmeli mi? | H. pylori'yi tanıyor musunuz? | H. pylori muayenesi yapmak gerekli midir? | H. pylori enfeksiyonunun olumsuz sonuçlarını anlıyor musunuz? | |
Evet (oran) | 236 (90.4%) | 59 (22.6%) | 117 (44.8%) | 237 (90.8%) | 104 (39.8%) |
Hayır (oran) | 25 (9.6%) | 202 (77.4%) | 144 (55.2%) | 24 (9.2%) | 157 (60.2%) |
Tablo 1: Anket sonuçları.
H. pylori antijeni | Toplam | |||
Pozitif (+) | Olumsuz (-) | |||
qPCR (Kısmi Çözünürlük) | Pozitif (+) | 50 | 33 | 83 |
Olumsuz (-) | 2 | 176 | 178 | |
Toplam | 52 | 209 | 261 |
Tablo 2: İki tekniğin tanısal sonuçları.
Pozitif | Negatif | Pozitif oran | Toplam | |
Shitan köyü | 52 | 209 | 19.92% | 261 |
Çin | 314423 | 449404 | 42.80% | 763827 |
Tablo 3: Shitan Köyü ile ulusal ortalama arasında H. pylori tarama pozitiflik oranlarının karşılaştırılması.
H. pylori, tüm dünyada en yaygın bakteriyel enfeksiyonlardan birini temsil eder15. Anket sonuçları, toplumun %55.2'sinin H. pylori farkındalığının olmadığını, %90.8'inin ise H. pylori taramasının gerekli olduğuna inandığını ortaya koydu. Bu bulgular, ekonomik olarak dezavantajlı ve uzak bölgelerde H. pylori tarama programlarının uygulanmasının önemini vurgulamaktadır16. Üre nefes testi (UBT) yaygın bir tanı yöntemi olmasına rağmen maliyetinin yüksek olması, çocuklar ve gebeler için uygun olmaması uygulanabilirliğini sınırlamaktadır17,18. Serum H. pylori antikor testi, bir hastanın serumundaki antikorları tespit edebilir19. Bununla birlikte, bu test tedavi sonrası analiz için uygun değildir, çünkü antikorlar bakteriler temizlendikten sonra uzun süre kalır20. Buna karşılık, dışkı antijen testi, mide boşluğuna erişim ihtiyacını ortadan kaldıran ve analiz için yalnızca dışkı örnekleri gerektiren, invaziv olmayan bir yaklaşım sunar. Bu yöntem, hasta rahatsızlığını ve potansiyel riskleri önemli ölçüde azaltarak hem tarama hem de takip için daha uygun hale getirir. Ek olarak, istilacı olmayan doğası, onu uzak ve az gelişmiş bölgelerdeki popülasyonlar için daha kabul edilebilir hale getirir.
Çalışma popülasyonumuzda H. pylori pozitif hastaların prevalansı %19,92 olup, bu oran ulusal pozitif oran olan %42,8'den biraz daha düşüktür14. Ki-kare testine göre (P < 0.01) aralarında istatistiksel anlamlılık vardı. Bu farkın nedeni, Çin'in yedi coğrafi bölgesindeki kentsel popülasyonlarda H. pylori'nin enfeksiyon oranının belirgin bir bölgesel farklılaşmaya sahip olması olabilir21. Enfeksiyon oranı Doğu Çin'de en yüksek, Kuzeydoğu Çin, Kuzey Çin ve Kuzeybatı Çin'de daha yüksek ve Güney Çin ve Güneybatı Çin'de daha düşüktür21. Taradığımız bölge Güney Çin'e ait ve enfeksiyon oranı ulusal seviyeden daha düşük. Öte yandan, tek tek dışkı örneklerinin numune alma sürecindeki standart dışı işlem ve test için gönderilme süresinin uzun olması da bu farkın nedenleri olabilir. PCR ve türevleri, H. pylori dahil olmak üzere çeşitli patojenleri tespit etmek için yaygın olarak kullanılmasına rağmen, faydaları, termosikler ekipmanının karmaşıklığı ve maliyeti ve uzman operatörlere duyulan ihtiyaç ile sınırlıdır22,23. Bu çalışmada, qPCR sonuçları ile karşılaştırıldığında, dışkıda H. pylori antijeninin saptanmasının duyarlılığı ve özgüllüğü %60.24 ve %80.08 idi. Dışkı ve qPCR sonuçlarındaki H. pylori antijeninin tutarlılığı karşılaştırıldı ve sonuçlar orta derecede tutarlı olduklarını gösterdi (Kappa = 0.630, P < 0.05). Yetersiz hassasiyetinin nedenleri, düzensiz numune toplama, numune saklama sıcaklığı ve teslim süresinden etkilenebilir.
H. pylori enfeksiyonu fekal antijeninin tespiti için çift antikorlu sandviç yöntemi, etkili ve spesifik bir immünolojik tespit teknolojisidir. Bu yöntemin özü, antikorların spesifik bağlanma yeteneğinden yararlanmak ve ustaca bir tespit sistemi aracılığıyla hedef antijenlerin doğru bir şekilde tanımlanmasını ve miktar tayinini sağlamaktır. Spesifik olarak, bu yaklaşım iki temel adımı içerir: antijen yakalama ve antikor tespiti. Bu teknolojinin şematik diyagramı Şekil 5'te gösterilmiştir.
Polyester membran tespit bölgesi (T) üzerine kaplanmış fare anti-Hp antikoru, dışkıda H. pylori antijeninin spesifik olarak yakalanmasını sağlamak için H. pylori VacA epitopunu hedefler. VacA antijeni, enfeksiyonla yakından ilişkili olan H. pylori'nin önemli bir ekzotoksinidir. VacA'yı hedefleyen antikorlar, bir antijen-antikor kompleksi oluşturarak antijeni etkili bir şekilde tanımlayabilir ve ona bağlanabilir. Bu nedenle, bu yöntemin diğer gastrointestinal hastalıklar veya hastalıklarla çapraz reaksiyona girmesi kolay değildir.
Test sırasında, sıvı numune algılama tankına girer ve kılcal hareket yoluyla yukarı doğru hareket eder. Numune H. pylori antijeni içeriyorsa, önce polyester film üzerine kaplanmış lateks etiketli fare anti-H. pylori antikoru ile bir antijen-antikor kompleksi oluşturur. Kompleks, algılama bölgesinden (T) akarken, hareketsizleştirilmiş fare anti-H. pylori antikoru tarafından yakalanır ve bu da algılama bölgesinde (T) görünür bir kırmızı bant ile sonuçlanır ve bu da pozitif bir sonucu gösterir. Numunede H . pylori antijeni yoksa, tespit bölgesinde (T) çift antikor sandviç kompleksi oluşmaz ve sonuç olarak negatif bir sonucu gösteren kırmızı bant görünmez. H. pylori antijeninin varlığına veya yokluğuna bakılmaksızın, lateks-BSA-biyotin konjugatı, kromatografi sırasında zar üzerinde hareketsiz hale getirilen streptavidine bağlanacak ve kalite kontrol bölgesinde (C) kırmızı bir bant oluşturacaktır. Bu kırmızı bant, hem uygun kromatografik işlemin bir göstergesi hem de reaktif için dahili kontrol standardı olarak hizmet eder.
Çift antikorlu sandviç yöntemi, dikkatlice tasarlanmış antikorlar ve belirteçler tarafından dışkıda H. pylori antijeninin verimli bir şekilde yakalanmasını ve kalitatif tespitini gerçekleştirir. Basitliği, hızlılığı ve yüksek özgüllüğü, H. pylori enfeksiyonunun yardımcı tanısı için güvenilir teknik destek sağlar. Bu teknolojinin yaygın olarak uygulanması, yalnızca tıbbi maliyetleri azaltmak ve tarama verimliliğini artırmakla kalmaz, aynı zamanda hastalara daha rahat ve rahat bir test deneyimi sağlar. Bu ilerleme, H. pylori enfeksiyonunun küresel olarak önlenmesi ve kontrolü için büyük önem taşımaktadır.
Ek olarak, dışkı antijen testinin hijyeni kritik bir husustur. Bu yöntem, toplama süresinde belirli bir kısıtlama olmaksızın, şekillendirilmiş veya biçimlendirilmemiş olabilen taze dışkı örnekleri gerektirir. Numune toplama sırasında su, idrar, dezenfektanlar veya kanalizasyon ile kontaminasyondan kaçınmak önemlidir. Dışkı örnekleri, koruyucu ve deterjan içermeyen temiz, kuru kaplarda toplanmalıdır. Depolama gerekliyse, numuneler oda sıcaklığında en fazla 6 saat veya 2-8 °C'de 72 saate kadar saklanabilir. Doğru sonuçlar elde etmek için soğutulmuş numuneler testten önce oda sıcaklığına geri getirilmelidir. Yüksek zaman verimliliği de dışkı H. pylori enfeksiyonu antijen tespitinin önemli bir özelliğidir. Lateks bazlı çift antikorlu sandviç testi, laboratuvar sonuçlarının beklenmesini gerektiren geleneksel yöntemlere kıyasla 10-20 dakika içinde sonuç verebilir, bu da uzak ve geri kalmış bölgelerde akut enfeksiyonun tanınması ve erken tedavi kararları için önemlidir.
Özetle, dışkı H. pylori antijen tespiti, non-invazivlik, basitlik, hijyen, yüksek verimlilik ve geniş uygulanabilirlik dahil olmak üzere çok sayıda metodolojik avantaj sunar. Bu özellikler, bu yöntemi klinik uygulama için değerli bir araç haline getirir ve teşhis teknolojilerinin gelecekteki gelişimi için yenilikçi bilgiler sağlar. Sınırlı sağlık koşullarına sahip az gelişmiş bölgelerde, bu yaklaşım H. pylori enfeksiyonunun tanı ve tedavisinde çok önemli bir rol oynamaya hazırdır.
Yazarların beyan edebilecekleri herhangi bir çıkar çatışması yoktur.
Hiç kimse
Name | Company | Catalog Number | Comments |
DNA extraction kit | Jiangsu mole biotechnology co., ltd | 20230223 | None |
H. pylori fecal antigen detection kit | Hangzhou nuohui healthy technology co., ltd | 20213401126 | None |
H. pylori nucleic acid detection kit | Jiangsu mole biotechnology co., ltd | 20230226 | None |
Real-time fluorescence quantitative PCR | Shanghai Hongshi medical treatment technology co., ltd | 20183221659 | None |
Statistical Product and Service Solutions | IBM company | None | None |
Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi
Izin talebiThis article has been published
Video Coming Soon
JoVE Hakkında
Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır