16S rRNA测序:基于PCR的技术，用于识别细菌物种

1. 在处理微生物时，需要遵循良好的微生物实践。所有微生物，特别是未知样品，都应作为潜在的病原体处理。遵循无菌技术，避免污染样品、研究人员或实验室。处理细菌前后洗手，使用手套，并穿防护服。
2. 对基因组DNA分离和PCR产品纯化的实验方案进行风险评估。有些试剂可能是有害的！
3. 纯培养对16S rRNA测序至关重要。在继续分离基因组DNA之前，确保起始材料是完全纯净的。这可以通过条纹电镀来隔离单个菌落。如果需要，这些可以单独在盘子上或肉汤中进一步生长。
4. 需要实验室设备:
   1. 用于 PCR 的热循环器。热循环器的功能是根据设定的程序提高和降低温度。创建程序时，系统将要求您输入每个 PCR 步骤的温度和时间值以及循环总数。
   2. 阿加玫瑰凝胶电泳系统。它用于根据DNA片段的大小和电荷分离DNA片段。在此协议中，阿加糖凝胶电泳将用于可视化分离基因组DNA和PCR产品的质量。

2. 议定书

注意:演示的规程适用于纯细菌培养的16S rRNA基因测序。它不适用于基因组学研究。

1. 培养细菌以分离基因组DNA（gDNA）。
   1. 在合适的培养基上培养微生物。此步骤中可同时使用液体和固体介质。选择能产生最佳增长的条件。在计划实验时，请记住，缓慢生长的细菌可能需要几天才能达到晚点/静止生长阶段。在此协议中，在200rpm、37°C的摇动培养箱中一夜之间生长在乳原菌（LB）中。
2. gDNA 的隔离。
   1. 如果细菌生长在固体介质上，使用无菌循环刮擦一些细胞，并将其重新悬浮在1 mL的蒸馏水中
   2. 如果细菌在液体培养基中生长，则使用大约 1.5 mL 的隔夜培养液。
   3. 通过离心（1分钟，12，000 - 16，000 μ g）对细胞进行细胞细胞，去除上清液，并使用商用试剂盒或标准协议使用细胞进行gDNA分离[例如，CTAB总DNA制备（13）或苯酚氯仿提取（14）]。在这里，一个商业试剂盒用于从1.5 mL的B.subtilis 168过夜培养物中分离gDNA，OD₆₀₀ = 1.5。
      注1:对于一些革兰氏阴性细菌，这一步可以省略，并替换为简单的释放DNA从细胞沸腾。将细菌颗粒重新悬浮在蒸馏水中，并在100°C的加热块中孵育10分钟。
      注2:革兰氏阳性细菌细胞难以破坏。因此，建议选择一种gDNA分离方法或试剂盒，专门用于从这组细菌中分离。
3. gDNA质量检查。
   1. 通过胶质胶电泳检查分离的gDNA的质量。首先，将5μL的分离gDNA与1μL的加载染料（6x）混合，并将样品加载到含有DNA染色试剂的0.8%角糖凝胶上。
   2. 加载分子质量标准并运行电泳，直到染料正面到达凝胶底部。
   3. 电泳完成后，将凝胶可视化到合适的透光器（紫外线或蓝光）。gDNA 显示为一个厚厚的高分子带（超过 10 kb）。gDNA质量检查的一个示例如图3所示。
   4. 如果gDNA通过质量控制（即存在高分子带，并且 gDNA 几乎没有涂抹），则通过首先将 3 个微离心管按如下标签进行稀释，如下所示:"10x"、"100x"和"1000x"。
   5. 将90μL的无菌蒸馏水放入3个管中的每一个。
   6. 取10μL的gDNA溶液，并将其添加到标有"10x"的管中。
   7. 彻底调入整个体积（即100μL），以确保溶液均匀混合。然后，从这个管子中拿出10μL的溶液，并将其转移到标有"100x"的管中。
   8. 如前所述混合，通过将溶液的 10 μL 从管"100x"转移到管"1000x"来重复相同的过程。这些稀释剂将用作PCR反应的模板。

图 3:从亚蒂利杆菌中分离出的gDNA的甘蔗糖凝胶电泳。车道 1:M - 分子质量标记（从上到下:10000 bp、8000 bp、6000 bp、5000 bp、4000 bp、3500 bp、3000 bp、2500 bp、2000 bp、1500 bp、1000 bp）。巷2:gDNA-基因组DNA从杆菌分离。请点击此处查看此图的较大版本。

4. PCR扩增16S rRNA基因。
   注意:下面的PCR协议针对特定的DNA聚合酶和底漆对8F - 1492R进行了优化（见表1）。每个聚合酶和底漆对都需要优化该协议。
   1. 解冻冰上的所有试剂。
   2. 准备 PCR 主混音，如表 2 所示。由于DNA聚合酶在室温下是活跃的，因此必须在冰上进行反应设置，即PCR管和反应成分应始终保存在冰上。为每个gDNA样品制备一个反应，为阴性对照准备一个反应。阴性对照是一种没有gDNA模板的PCR混合物，用于确保反应的其他成分不受污染。
      注意:在多个样品的情况下，通常准备主组合。主混合是包含除模板之外的所有反应组件的解决方案。它有助于省略重复移液，避免移液错误，并确保样品之间的高度一致性。要准备主组合，请将每个组分（DNA模板除外）的体积乘以测试的样本数。混合微离心管中的所有组件，将整个体积上下调高几次。
   3. 主混合物的等分 49 μL 进入单个 PCR 管中。
   4. 将 1 μL 模板添加到带主混合的管中。对于负控制，添加 1 μL 无菌水。为确保组件充分混合，请用移液器设置为 30-50μL 轻轻移液 10 次。
   5. 使用表 3 所示的程序设置 PCR 机器。
   6. 将管放入 PCR 机器并启动程序。
   7. 程序完成后，通过胶质电泳检查PCR产品的质量。
   8. 使用 8F-1492R 底漆对成功的 PCR 反应产生大约 1.5 kb 的单波段（图 4）。如果存在其他频带（即非特定产品），则通过调整退火温度来优化 PCR 程序。如果存在预期大小的单个波段，则继续执行下一步。在这里，PCR反应与100倍稀释gDNA模板产生了最好的产品，因为它有一个锋利的带预期大小，缺乏非特异性产品。因此，它被选择被纯化并送去测序。
   9. 在测序之前，必须从PCR反应中存在的残留底漆、脱氧核苷酸、聚合酶和缓冲液中清除产品。PCR 产品可以使用商用 PCR 纯化套件进行隔离。PCR 反应加载在包含 DNA 结合基质的列上。PCR 产品绑定到列，而其他组件流经列。然后使用洗涤缓冲液洗涤柱，最后，DNA在选择的缓冲液中洗脱。确认随试剂盒补充的洗脱缓冲液与排序兼容。
   10. 发送纯化的PCR产物进行DNA测序。遵循在所选测序设施提交测序样本的准则。为了获得最佳序列覆盖率，请使用 PCR 扩增引子（与第 2.4.1 节中使用的相同）作为测序引子。此处，引注 8F 和 1492R 用于 PCR 产品测序。

表 2:PCR 反应组分。• 使用步骤 2.3 中的 10 倍、100 倍或 1000x 稀释 gDNA。

表 3:用于16S rRNA基因扩增的PCR程序。

图 4:以引体8F、1492R和gDNA为模板的PCR产物的Agarose凝胶电泳。B. subtilis的 gDNA 样本（见图 3）被稀释了 10、100 和 1000 次，以测试最佳结果。车道 1: M - 分子质量标记（从上到下:10000 bp、8000 bp、6000 bp、5000 bp、4000 bp、3500 bp、3000 bp、2500 bp、2500 bp、1500 bp、1500 bp、750 bp、500 bp、250 bp）。车道 2:PCR反应与10倍稀释模板。车道 3:PCR反应与100倍稀释模板。车道 4:PCR反应与1000x稀释模板。车道5:（C-） - 阴性对照（无DNA模板的反应）。请点击此处查看此图的较大版本。

3. 数据分析和结果

注意:PCR 产品使用正向（此处为 8F）和反向（此处为 1492R）引漆进行排序。因此，生成两组数据序列，一组用于正向，一组用于反向引注。对于每个序列，至少生成两种类型的文件:i） 包含 DNA 序列的文本文件;ii） DNA 色谱图，显示测序运行的质量。

1. 对于正向底漆，打开色谱图，并仔细检查序列。质量序列的理想色谱图应具有均匀间距的峰值和很少或根本没有背景信号（图 5A）。
2. 如果色谱图质量不高，应丢弃序列，或者根据以下内容修改序列文本文件:
   1. 整个色谱图中存在双峰表示存在多个 DNA 模板。如果细菌培养物不纯，情况可能就是如此。应丢弃此类序列 （图5B）。
   2. 由于同一位置存在不同颜色的峰值，可能会出现模棱两可的色谱图。最常见的错误之一是两个不同颜色的峰值位于同一位置，并且排序软件对基的分配不当（图5C）。手动更正任何分配错误的核苷酸，并在文本文件中对其进行编辑。
   3. 低分辨率色谱图可能导致"广泛峰"，这通常会导致这些区域的核苷酸计数错误（图5D）。此错误难以纠正，因此不应将进一步对齐步骤中可能出现的不匹配视为可靠。
   4. 色谱图读数质量差，且存在多个峰值，通常出现在序列的 5' 和 3' 端。某些音序器软件会自动删除这些低质量片段（图5E），并且核苷酸不包括在文本文件中。如果序列未自动截断，请确定末端的低质量片段（例如弱信号、重叠峰值、分辨率损失），并从文本文件中删除相应的基。

图 5:DNA测序故障排除示例。A） 质量色谱图序列的示例（均匀间距、明确的峰值）。B） 质量较差的序列，通常发生在色谱图的开头。灰色区域被视为低质量，由排序软件自动删除。可以手动修剪更多基。C） 存在双峰（用箭头表示）。由红色箭头指示的核苷酸已被序列器读取为"T"（红色峰值），但蓝色峰值更强，也可以解释为"C"。D） 重叠峰表示DNA污染（即多个模板）。E） 分辨率损失和所谓的"宽峰"（以矩形标记），阻止可靠的基点调用。请点击此处查看此图的较大版本。

3. 对反向底漆重复 3.1 和 3.2。
4. 最后，将正向和反向序列组装成一个连续序列。良好的测序运行产生高达1100 bp的序列。 考虑到PCR产物长1500bp，使用正向和反向引漆获得的序列应部分重叠。
   1. 使用 DNA 序列组装程序合并两个序列，例如CAP3 （http://doua.prabi.fr/software/cap3） （15） 等免费工具。
   2. 将 FASTA 格式的两个序列插入到指示框中。单击"提交"按钮并等待结果返回。
   3. 要查看已组装的序列，请按结果选项卡中的"Contigs"。要查看对齐的详细信息，请按"装配详细信息"。
      注1:如果使用 CAP3 软件进行相邻装配，则无需将反向引油序列转换为反向互补;但是，如果使用其他程序，则可能需要此步骤。
      注2:FASTA 格式是一种基于文本的格式，用于表示核苷酸序列。FASTA 文件中的第一行（描述行）以符号">"开头，后跟序列的名称或唯一标识符。描述线之后是核苷酸序列。以以下格式粘贴序列:
      
      >序列_frw_引基
      在此处从文本文件粘贴序列
      >序列_rvs_底漆
      在此处从文本文件粘贴序列
5. 通过访问基本本地对齐搜索工具（BLAST;https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）的网站进行数据库搜索。
   1. 选择"核苷酸 BLAST"工具，将序列与数据库进行比较。
   2. 将序列（在 3.5 中组装的连续序列）输入"查询序列"文本框中，然后在向下滚动菜单中选择数据库"16S rRNA 序列（细菌和 Archea）。"。
   3. 按页面底部的"BLAST"按钮。将返回最相似的序列。图 6显示了一个示例 BLAST 结果。在提出的实验中，最热门的是B.subtilis菌株168，显示100%的标识与BLAST数据库中可用的序列。
   4. 如果热门命中未显示 100% 标识，请转到对齐路线并检查不匹配。单击顶部点击后，您将被定向到对齐的详细信息。对齐的核苷酸将由短的垂直线连接，而不匹配的核苷酸之间有间隙。返回到从测序公司收到的色谱图，并再次修改序列，重点是不匹配的区域。如果发现任何其他错误，请更正该序列。使用更正的序列再次运行 BLAST。

图 6:核苷酸BLAST结果示例。16S rRNA基因序列来自纯培养B.subtilis 168作为查询序列。命中顶部显示 100% 标识 （下划线） 到B. subtilis应变 168， 如预期.请点击此处查看此图的较大版本。