<p class="jove_content">怀特黑德研究所的研究员基金</p>

<p class="jove_title">第1部分：从RNA合成cDNA </p><ol><li>使用Ambion公司氨基烯丙基MessageAmp II套件之前，建议量的100％的乙醇添加到洗缓冲区。 </li><li>在PCR反应管中，加之间100ng的总RNA，以oligo（dT）引物的T7加入1μl5μg。把音量无核酸酶水至12μl。 </li><li>孵育样品在70℃，在热循环10分钟。 </li><li>删除从70℃，短暂离心的RNA样品。置于冰上。 </li><li>准备的<sup>第一</sup>链合成预混，并保持在室温（10％的移液错误的<strong>盘盈）（见表</strong> 1）。 </li><li>轻轻吸预混或轻弹混合，然后短暂离心。 </li><li>将主结构8μl转移到每个RNA样品。混合移液器向上和向下的3-4倍。 </li><li>在42 ° C孵育2小时在热循环。 </li><li>离心机样本简要置于冰上。立即进行下一步的双链DNA合成。 </li><li>准备在冰<sup>第二</sup>链的合成大师的组合（10％的移液错误的盘盈<strong>）（表</strong> 2） </li><li>轻轻吸预混或轻弹混合，然后短暂离心。 </li><li>每个样品转移80μl，轻轻混匀移液器向上和向下的3-4倍。 </li><li>在16℃孵育2小时在热循环。 </li><li>经过2个小时的潜伏期，进行cDNA的清理步骤，或立即冻结在-20 ° C。 </li></ol><p class="jove_title">第2部分：双链cDNA清理</p><ol><li>从冰箱中取出的cDNA纯，并允许它在使用前30分钟平衡至室温。摇动瓶子在使用前要充分重悬磁cDNA的约束力珠。 </li><li>分装成1.5ml离心管，并在50-60 ° C孵育至少10分钟，在过去的2小时潜伏期无核酸酶水。 </li><li>每个样品添加纯180μl的cDNA，并彻底混合向上和向下吹打。样品转移到一个96孔的圆底板。 </li><li>继续混合样品至少2分钟，轻轻晃动轨道摇床板。 </li><li>移动板磁性的立场，以捕获磁珠。留在板约6分钟的立场，或直到混合物变得透明和结合珠颗粒。 </li><li>小心吸上清液真空抽吸，而不会干扰磁珠。另外，用移液器小心取出上清，弃上清。 </li><li>删除从磁立场板。 </li><li>加入150μlcDNA的洗涤缓冲液，每孔摇动1分钟，速度适中的轨道摇床板。珠不会分散在这一步，由于洗涤缓冲液的表面张力低。 </li><li>移动板磁性的立场，以捕获磁珠。 </li><li>小心吸上清液真空抽吸，而不会干扰磁珠。另外，用移液器小心取出上清，弃上清。 </li><li>删除从磁立场板。 </li><li>重复与150μlcDNA的洗涤缓冲液洗2 <sup>次</sup>的时间。 </li><li>之后的第2 <sup>次</sup>洗，干燥摇晃以最快的速度为2分钟轨道摇床板的珠子。不要overdry！ </li><li>每个样品加入18μl预热无核酸酶水洗脱珠的cDNA。 </li><li>大力动摇盘3分钟轨道摇床，然后检查，以确保磁珠完全散去。如果没有，继续摇晃。 </li><li>一旦磁珠完全散去，移动板磁性的立场，以捕获磁珠。 </li><li>小心地转移到一个新的PCR板（或PCR管）洗脱的cDNA（〜16μl）。 </li><li>直接进入下一步，或冻结在-20 ° C的cDNA </li></ol><p class="jove_title">第3部分： <em>体外</em>转录（IVT） </p><ol><li>准备在室温下的IVT <strong>预混（见表3</strong> ） </li><li>轻轻吸液管硕士的组合或轻弹混合，并短暂离心​​。 </li><li>每个样品中加入24μl，轻轻混匀移液器向上和向下的3-4倍。 </li><li>在37 ° C孵育14小时的热循环，然后保持在4 ° C，直到为下一步做好准备。 </li></ol><p class="jove_title">第4部分：ARNA干净后IVT </p><ol><li>旋涡RNA结合珠简要地获取，使用前均匀混合。 </li><li> <strong>（见表4）</strong>这是可以做到提前准备ARNA绑定混合，在室温下-可以在室温下储存长达一个星期的准备约束力混合。 </li><li>由涡旋混合。 </li><li>分装成1.5ml离心管，并在50-60℃孵育至少10分钟的ARNA洗脱缓冲液。 </li><li>添加ARNA约束力混合70μl每个样品中，拌匀移液器向上和向下的3-4倍。 </li><li>样品PCR板转移到一个96孔的圆底板。 </li><li> 100％异丙醇每个样品中加入50μL拌匀移液器向上和向下的3-4倍。 </li><li>轻轻摇动至少2分钟，轨道摇床板，彻底混合样品。 </li><li>移动板磁性的立场，以捕获磁珠。离开盘上的立场，直到混合物变得透明和约束力珠颗粒。 </li><li>小心吸上清液真空抽吸，而不会干扰磁珠。另外，用移液器小心取出上清，弃上清。 </li><li>删除从磁立场板。 </li><li>加入100μLARNA每口井的清洗液，摇动1分钟，速度适中的轨道摇床板。珠可能无法完全分散在这一步。 </li><li>移动板磁性的立场，以捕获磁珠。 </li><li>小心吸上清液真空抽吸，而不会干扰磁珠。另外，用移液器小心取出上清，弃上清。 </li><li>删除从磁立场板。 </li><li>重复100μLARNA清洗液洗了<sup>第二</sup> 。 </li><li>之后的第2 <sup>次</sup>洗，干燥摇晃以最快的速度为1分钟的轨道摇床板的珠子。不要overdry的样品！ </li><li>每个样品加入40μl预热ARNA洗脱液洗脱珠ARNA。 </li><li>大力动摇盘3分钟轨道摇床，然后检查，以确保磁珠完全散去。如果没有，继续摇晃。 </li><li>一旦磁珠完全散去，移动板磁性的立场，以捕获磁珠。上清包含清理氨基烯丙基纳入ARNA。 </li><li>洗脱ARNA小心地转移到一个新的PCR板（或PCR管）。 </li><li> （可选步骤）检查上NanoDrop分光光度计测量1.5μlRNA浓度的样品。 </li><li>立即继续到下一个步骤，或存放于-80℃的ARNA ° C。 </li></ol><p class="jove_title">表1：cDNA的<sup>第一</sup>链合成预混</p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>试剂</strong> </td><td> <strong>金额为1反应</strong> </td></tr><tr><td> 10X第一链缓冲</td><td> 2μL </td></tr><tr><td> dNTP混合液</td><td> 4μL </td></tr><tr><td>核糖核酸酶抑制因子</td><td> 1μL </td></tr><tr><td>阵列脚本</td><td> 1μL </td></tr></tbody></table><p class="jove_title">表2：cDNA的<sup>第二</sup>链合成预混</p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>试剂</strong> </td><td> <strong>金额为1反应</strong> </td></tr><tr><td>核酸免费水</td><td> 63μL </td></tr><tr><td> 10X第二链缓冲</td><td> 10μL </td></tr><tr><td> dNTP混合液</td><td> 4μL </td></tr><tr><td> DNA聚合酶</td><td> 2μL </td></tr><tr><td>核糖核酸酶H </td><td> 1μL </td></tr></tbody></table><p class="jove_title">表3：IVT中的master mix </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>试剂</strong> </td><td> <strong>金额为1反应</strong> </td></tr><tr><td> aaUTP解决方案（75毫米） </td><td> 2μL </td></tr><tr><td> ATP，CTP，GTP的组合（25毫米） </td><td> 12μL </td></tr><tr><td> T7 UTP解决方案（75毫米） </td><td> 2μL </td></tr><tr><td> T7 10X反应缓冲液</td><td> 4μL </td></tr><tr><td> T7酶混合物</td><td> 4μL </td></tr></tbody></table><p class="jove_title">表4：ARNA绑定混合</p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>试剂</strong> </td><td> <strong>金额为1反应</strong> </td></tr><tr><td>核糖核酸*装订珠</td><td> 10μL </td></tr><tr><td>珠再悬浮解决方案* </td><td> 4μL </td></tr><tr><td> 100％的异丙醇** </td><td> 6μL </td></tr><tr><td> ARNA绑定缓冲液</td><td> 50μL </td></tr></tbody></table><p> *混合RNA结合珠与珠再悬浮溶液。 <br /> **添加异丙醇和拌匀之前加入ARNA结合缓冲液。 </p>

<ol>
	<li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection:+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes.">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> <em style='font-style: italic'>PLoS ONE</em>. <b>3</b> (7), e2628-e2628 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes.">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci</em>. <b>105</b> (6), 2140-2145 (2008).</li><li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+transcriptome+analysis.">Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E62-E62 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss:+Poxvirus+transcriptome+analysis.">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E63-E64 (2008).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., Mu&#241;oz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells.">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>77</b> (11), 6493-6506 (2003).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells.">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>78</b> (11), 5820-5824 (2004).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., N&#225;jera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC:+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells.">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>80</b> (2), 985-998 (2006).</li><li>Guerra, S., N&#225;jera, J. L., Gonz&#225;lez, J. M., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC.">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> <b>81</b> (16), 8707-8721 (2007).</li></ol>

<p class="jove_content">The authors have nothing to disclose.</p>

<p class="jove_title">关键步骤</p><p class="jove_content">一个放大的第二轮，是不是表示已经观察到数组中的数据的偏差。仔细搅拌在每个酶一步（ <sup>第一</sup>和<sup>第二</sup>链cDNA合成，IVT），取得了良好的扩增产量的关键，是在适当的温度孵化每个酶一步。一个可调节的热盖的PCR基因扩增仪是首选 - 甚至偏差，在IVT中为2-3度，空气杂交烘箱或水浴杂交小，可以显着影响产量的扩增产物。 </p><p class="jove_title">应用程序/意?...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>AM1753</td>
<td>For 20 reactions</td>
</tr>
<tr>
<td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>AM1821</td>
<td>For 100 reactions, in a 96-well format</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer</td>
<td>Other</td>
<td>NanoDrop</td>
<td>ND-1000</td>
<td>Or equivalent spectrophotometer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 2

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

<p class="jove_content">协议牛痘感染的HeLa细胞和宿主和病毒基因的表达分析。</p>

牛痘病毒感染及病毒基因表达的时空分析：第2部分

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

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Biology

7.9K 次观看.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. 协议牛痘感染的HeLa细胞和宿主和病毒基因的表达分析。