<p class="jove_content"> Whitehead Institute Fellows Fundos </p>

<p class="jove_title"> Parte 1: síntese de cDNA a partir de RNA </p><ol><li> Antes de usar o Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, adicionar o volume recomendado de etanol a 100% para os buffers de lavagem. </li><li> PCR em tubo de reação, adicione entre 100ng de 5μg de RNA total e 1μl de T7 oligo primer (dT). Trazer o volume até 12μl com água livre de nuclease. </li><li> Incubar as amostras a 70 ° C por 10 min em um termociclador. </li><li> Remover amostras de RNA a partir de 70 ° C e centrifugar brevemente. Colocar no gelo. </li><li> Preparar o 1 <sup>º</sup> Strand master mix Síntese e manter a temperatura ambiente (com excesso de 10% para pipetagem de erro). <strong>(Tabela 1)</strong> </li><li> Pipeta suavemente Mix Master ou filme para misturar e então centrifugar brevemente. </li><li> Transferência 8μl do Mix Master para cada amostra de RNA. Mix pipetando cima e para baixo 3-4 vezes. </li><li> Incubar a 42 ° C por 2 horas no termociclador. </li><li> Brevemente centrifugar amostras e colocar no gelo. Prosseguir imediatamente para a próxima etapa de síntese de dsDNA. </li><li> Prepare o <sup>2</sup> º Strand master mix de síntese sobre gelo (com sobrecarga de 10% para pipetagem de erro). <strong>(Tabela 2)</strong> </li><li> Pipeta suavemente Mix Master ou filme para misturar e então centrifugar brevemente. </li><li> Transferência Pipete 80 para cada amostra e misture suavemente pipetando cima e para baixo 3-4 vezes. </li><li> Incubar a 16 ° C por 2 horas no termociclador. </li><li> Após a incubação de 2 horas, prosseguir com a etapa de clean-up cDNA ou congelar imediatamente a -20 ° C. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 2: Double-stranded cDNA clean-up </p><ol><li> Remover o Pure cDNA do frigorífico e deixe-o atingir a temperatura ambiente por 30 minutos antes de usar. Agitar o frasco plenamente ressuspender o cDNA magnética contas obrigatórias antes do uso. </li><li> Alíquota de água livre de nuclease em um tubo de 1,5 ml e incubar a 50-60 ° C durante pelo menos 10 minutos durante a incubação prévia 2hr. </li><li> Adicionar 180μl de Pure cDNA de cada amostra, e misturar completamente por pipetagem cima e para baixo. Transferir as amostras para uma placa de 96 poços de fundo redondo. </li><li> Continue a misturar as amostras agitando a placa em agitador orbital por pelo menos 2 minutos. </li><li> Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. Deixe placa no stand por aproximadamente 6 minutos, ou até que a mistura torna-se transparente e os cordões de ligação a peletizada. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante. </li><li> Retire a placa do suporte magnético. </li><li> Adicionar 150μl tampão de lavagem cDNA a cada poço e agitar a placa por 1 minuto no agitador orbital a uma velocidade moderada. Contas não se dispersa nesta etapa, devido à baixa tensão superficial da solução de lavagem. </li><li> Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante. </li><li> Retire a placa do suporte magnético. </li><li> Repita a lavagem de cada vez <sup>2</sup> º com tampão de lavagem 150μl cDNA. </li><li> Após a lavagem <sup>2</sup> º, seca as contas agitando a placa por 2 minutos no agitador orbital à velocidade máxima. Não overdry! </li><li> Eluir o cDNA dos grânulos adicionando 18μl da água livre de nuclease pré-aquecido a cada amostra. </li><li> Agitar vigorosamente a placa por 3 minutos no agitador orbital, em seguida, verifique se a esferas magnéticas estão totalmente dispersos. Se não, continue a tremer. </li><li> Uma vez que a esferas magnéticas têm totalmente disperso, mova a placa a um suporte magnético para capturar as esferas magnéticas. </li><li> Transferir cuidadosamente o cDNA eluída (~ 16μl) para uma placa de PCR nova (ou tubos de PCR). </li><li> Prosseguir diretamente para a etapa seguinte, ou congelar o cDNA a -20 ° C. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 3: <em>transcrição</em> in <em>vitro</em> (IVT) </p><ol><li> Prepare a mistura mestre IVT à temperatura ambiente. <strong>(Tabela 3)</strong> </li><li> Pipeta suavemente o Mix Master ou filme para misturar e centrifugar brevemente. </li><li> Adicionar 24μl de cada amostra, e misture delicadamente por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes. </li><li> Incubar a 37 ° C por 14 horas em um termociclador, então segure a 4 ° C até que esteja pronto para a próxima etapa. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 4: ARNA clean-up após IVT </p><ol><li> Vortex as contas RNA ligação rapidamente para obter uma mistura mesmo antes do uso. </li><li> Preparar a mistura ARNA Binding à temperatura ambiente <strong>(Tabela 4)</strong> Isso pode ser feito antes do tempo -. A mistura preparada ligação pode ser armazenado em temperatura ambiente por até uma semana. </li><li> Misture bem em vórtice. </li><li> Alíquota do tampão de eluição ARNA em um tubo de 1,5 ml e incubar a 50-60 ° C durante pelo menos 10 minutos. </li><li> Adicionar 70μl da mistura obrigatória ARNApara cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes. </li><li> Transferência das amostras da placa de PCR para uma placa de 96 poços de fundo redondo. </li><li> Adicionar 50μl de isopropanol 100% a cada amostra e misture bem por pipetagem cima e para baixo 3-4 vezes. </li><li> Agitar suavemente a placa em agitador orbital por pelo menos 2 minutos para misturar as amostras. </li><li> Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. Deixar a placa no stand até que a mistura torna-se transparente e os cordões de ligação a peletizada. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante. </li><li> Retire a placa do suporte magnético. </li><li> Adicionar 100μl de solução de lavagem ARNA a cada poço e agitar a placa por 1 minuto no agitador orbital a uma velocidade moderada. Contas não pode se dispersar totalmente nesta etapa. </li><li> Mova a placa para um suporte magnético para capturar a esferas magnéticas. </li><li> Aspirar cuidadosamente o sobrenadante com um aspirador a vácuo, sem perturbar a esferas magnéticas. Como alternativa, remova cuidadosamente o sobrenadante com uma pipeta e desprezar o sobrenadante. </li><li> Retire a placa do suporte magnético. </li><li> Repita a lavagem de cada vez <sup>2</sup> º com 100μl de solução de lavagem ARNA. </li><li> Após a lavagem <sup>2</sup> º, seca as contas agitando a placa por 1 minuto no agitador orbital à velocidade máxima. Não overdry as amostras! </li><li> Eluir a ARNA dos grânulos adicionando 40μl tampão de eluição ARNA pré-aquecido para cada amostra. </li><li> Agitar vigorosamente a placa no agitador orbital por 3 minutos, em seguida, verifique se a esferas magnéticas estão totalmente dispersos. Se não, continue a tremer. </li><li> Uma vez que a esferas magnéticas têm totalmente disperso, mova a placa a um suporte magnético para capturar as esferas magnéticas. O sobrenadante contém a limpo-up amino-alil ARNA incorporadas. </li><li> Transferir cuidadosamente o ARNA eluída a uma placa de PCR nova (ou tubos de PCR). </li><li> (Passo opcional) Verificar a concentração de RNA das amostras medindo 1.5μl em um espectrofotômetro NanoDrop. </li><li> Imediatamente continue para a próxima etapa, ou armazenar a ARNA a -80 ° C. </li></ol><p class="jove_title"> Tabela 1: 1 Strand cDNA <sup>º</sup> Mix Master Síntese </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Reagente</strong> </td><td> <strong>Montante para uma reação</strong> </td></tr><tr><td> Tampão Strand 10X Primeiro </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Inibidor ribonuclease </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Script da Matriz </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> Tabela 2: 2 <sup>ª</sup> Strand cDNA Mix Master Síntese </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Reagente</strong> </td><td> <strong>Montante para uma reação</strong> </td></tr><tr><td> Água livre de nuclease </td><td> 63 mL </td></tr><tr><td> Tampão 10X Segundo Strand </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> DNA Polimerase </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> RNase H </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> Tabela 3: IVT Master Mix </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Reagente</strong> </td><td> <strong>Montante para uma reação</strong> </td></tr><tr><td> aaUTP solução (75 mM) </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> ATP, CTP, GTP mix (25 mM) </td><td> 12 mL </td></tr><tr><td> T7 UTP solução (75 mM) </td><td> 2 l </td></tr><tr><td> T7 Tampão de reacção 10X </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> T7 Mix Enzyme </td><td> 4 mL </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> Tabela 4: ARNA Mix Binding </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Reagente</strong> </td><td> <strong>Montante para uma reação</strong> </td></tr><tr><td> Beads RNA Binding * </td><td> 10 ml </td></tr><tr><td> Bead * Solução ressuspensão </td><td> 4 mL </td></tr><tr><td> Isopropanol 100% ** </td><td> 6 mL </td></tr><tr><td> ARNA Concentrado de tampão de ligação </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table><p> * Mix as contas RNA ligação com a solução de ressuspensão primeira conta. <br /> ** Adicione o isopropanol e misturar bem antes de adicionar o ARNA concentrado de tampão de ligação. </p>

<ol>
	<li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection:+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes.">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> <em style='font-style: italic'>PLoS ONE</em>. <b>3</b> (7), e2628-e2628 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes.">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci</em>. <b>105</b> (6), 2140-2145 (2008).</li><li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+transcriptome+analysis.">Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E62-E62 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss:+Poxvirus+transcriptome+analysis.">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E63-E64 (2008).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., Mu&#241;oz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells.">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>77</b> (11), 6493-6506 (2003).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells.">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>78</b> (11), 5820-5824 (2004).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., N&#225;jera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC:+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells.">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>80</b> (2), 985-998 (2006).</li><li>Guerra, S., N&#225;jera, J. L., Gonz&#225;lez, J. M., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC.">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> <b>81</b> (16), 8707-8721 (2007).</li></ol>

<p class="jove_content">The authors have nothing to disclose.</p>

<p class="jove_title"> Passos crítica </p><p class="jove_content"> A segunda etapa de amplificação não é aconselhável como preconceitos em dados de matriz foram observados. Misturando com cuidado a cada passo enzimático (1 <sup>ª</sup> e 2 <sup>ª</sup> vertente de síntese de cDNA, FPI) é fundamental para a obtenção de rendimentos de amplificação boa, como é de incubação de cada etapa enzimática na temperatura adequada. A cycler PCR com tampa aquecida ajustável é o preferido - desvios ainda tão pequeno quanto 2-3 graus dura...

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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>AM1753</td>
<td>For 20 reactions</td>
</tr>
<tr>
<td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>AM1821</td>
<td>For 100 reactions, in a 96-well format</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer</td>
<td>Other</td>
<td>NanoDrop</td>
<td>ND-1000</td>
<td>Or equivalent spectrophotometer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 2

<p class="jove_content">A família<em&gt; Poxviridae</em&gt; Consiste de DNA double-stranded grandes contendo vírus que se replicam exclusivamente no citoplasma das células infectadas. Membros da<em&gt; Orthopox</em&gt; Gênero incluem a varíola, o agente causador da varíola humana, macacos, e vaccinia (VAC), o membro protótipo da família de vírus. Dentro do relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, três classes de genes são codificados: precoce, intermediária e final. Enquanto todas as três classes são transcritos pela polimerase viral codificado RNA, cada classe tem uma função diferente no ciclo de vida do vírus. Poxvírus utilizar múltiplas estratégias para a modulação do ambiente celular do hospedeiro durante a infecção. A fim de compreender a regulação de ambos os host e expressão do gene do vírus, nós utilizamos genome-wide abordagens para analisar a abundância transcrição de ambos os vírus e células hospedeiras. Aqui, demonstramos infecções tempo de percurso de células HeLa com Vaccinia vírus RNA e amostragem em vários intervalos de tempo pós-infecção. Ambos os host e viral RNA total é isolado e amplificado para a hibridização de microarrays para a análise da expressão gênica.</p>

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

<p class="jove_content">Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 2 de 3.</p>

Infecção pelo Vírus Vaccinia e Análise Temporal da Expressão Gênica de Vírus: Parte 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

7.9K visualizações.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. Protocolo para Vaccinia infecção de células HeLa e análise de host e expressão gênica viral. Parte 2 de 3.