<p class="jove_content"> Whitehead Institute Fellows Fondi </p>

<p class="jove_title"> Parte 1: sintesi di cDNA da RNA </p><ol><li> Prima di utilizzare il Amino Ambion allile MessageAmp II kit, aggiungere il volume consigliato del 100% di etanolo al tamponi di lavaggio. </li><li> In tubo di reazione PCR, aggiungere tra 5μg a 100 ng di RNA totale e 1ml di T7 oligo (dT) primer. Portare il volume fino a 12μl con acqua priva di nucleasi. </li><li> Incubare i campioni a 70 ° C per 10 minuti in un termociclatore. </li><li> Rimuovere campioni di RNA da 70 ° C e centrifugare brevemente. Mettere in ghiaccio. </li><li> Preparare lo Strand 1 <sup>°</sup> mix di sintesi master e tenere a temperatura ambiente (con il 10% carico eccessivo per il pipettaggio errore). <strong>(Tabella 1)</strong> </li><li> Delicatamente Master Mix pipetta o sfiorare per mescolare, quindi si centrifuga brevemente. </li><li> Trasferimento 8μl del Master Mix per ogni campione di RNA. Mescolare pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Incubare a 42 ° C per 2 ore in termociclatore. </li><li> Centrifugare i campioni brevemente e posto sul ghiaccio. Procedere immediatamente alla fase successiva della sintesi dsDNA. </li><li> Preparare il Settore 2 <sup>°</sup> mix di sintesi master sul ghiaccio (con il 10% carico eccessivo per il pipettaggio errore). <strong>(Tabella 2)</strong> </li><li> Delicatamente Master Mix pipetta o sfiorare per mescolare, quindi si centrifuga brevemente. </li><li> Trasferire 80μl di ciascun campione e mescolare delicatamente pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Incubare a 16 ° C per 2 ore in termociclatore. </li><li> Dopo l&#39;incubazione 2 ore, procedere con il cDNA clean-up o step congelare immediatamente a -20 ° C. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 2: doppia elica del DNA di pulizia </p><ol><li> Rimuovere il puro cDNA dal frigorifero e lasciarlo equilibrare a temperatura ambiente per 30 minuti prima dell&#39;uso. Agitare il flacone per sospendere di nuovo pienamente le sfere magnetiche cDNA vincolante prima dell&#39;uso. </li><li> Aliquota nucleasi senza acqua in un tubo di 1,5 ml ed incubare a 50-60 ° C per almeno 10 minuti durante l&#39;incubazione precedente 2 ore. </li><li> Aggiungere 180μl di Pure cDNA per ogni campione, e mescolare bene pipettando su e giù. Trasferire i campioni ad un 96-ben a fondo rotondo piatto. </li><li> Continuare a mescolare i campioni scuotendo leggermente il piatto su un agitatore orbitale per almeno 2 minuti. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Lascia piastra sul supporto per circa 6 minuti, o fino a quando il composto diventa trasparente e le palline sono vincolanti pellet. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Aggiungere 150μl cDNA tampone di lavaggio in ogni bene e agitare la piastra per 1 minuto l&#39;agitatore orbitale a velocità moderata. Perline NON si disperderà in questa fase, a causa della bassa tensione superficiale del tampone di lavaggio. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Ripetere il lavaggio per volta 2 <sup>°</sup> con 150μl tampone di lavaggio cDNA. </li><li> Dopo il 2 <sup>°</sup> lavare, asciugare le perle agitando la piastra per 2 minuti in agitatore orbitale alla massima velocità. Non asciugare eccessivamente! </li><li> Eluire il cDNA dalla perle aggiungendo 18μl del preriscaldato nucleasi acqua priva di ogni campione. </li><li> Agitare vigorosamente la piastra per 3 minuti mediante l&#39;agitatore orbitale, quindi controllare per assicurarsi che le sfere magnetiche sono completamente disperse. In caso contrario, continuare a tremare. </li><li> Una volta che il sfere magnetiche sono completamente dispersi, spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;cDNA eluiti (~ 16μl) ad una nuova piastra PCR (PCR o tubi). </li><li> Procedere direttamente alla fase successiva, o congelare il cDNA a -20 ° C. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 3: Trascrizione <em>in vitro</em> (IVT) </p><ol><li> Preparare la master mix IVT a temperatura ambiente. <strong>(Tabella 3)</strong> </li><li> Delicatamente pipetta Master Mix o sfiorare per miscelare e centrifugare brevemente. </li><li> Aggiungere 24μl di ciascun campione e mescolare delicatamente pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Incubare a 37 ° C per 14 ore in un termociclatore, quindi tenere a 4 ° C fino al momento per il passo successivo. </li></ol><p class="jove_title"> Parte 4: ARNA pulizia dopo IVT </p><ol><li> Vortex le perline RNA vincolante per breve tempo ad ottenere un impasto omogeneo prima dell&#39;uso. </li><li> Preparare il Mix Binding ARNA a temperatura ambiente <strong>(Tabella 4)</strong> Questo può essere fatto prima del tempo -. Mix preparato vincolante può essere conservato a temperatura ambiente per un massimo di una settimana. </li><li> Mescolare bene nel vortex. </li><li> Aliquota del buffer di eluizione ARNA in un tubo di 1,5 ml ed incubare a 50-60 ° C per almeno 10 minuti. </li><li> Aggiungere 70μl della miscela ARNA vincolantead ogni campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Trasferimento dei campioni dalla piastra PCR ad un 96-ben a fondo rotondo piatto. </li><li> Aggiungere 50μl del 100% di isopropanolo a ciascun campione e mescolare bene pipettando su e giù per 3-4 volte. </li><li> Agitare delicatamente la piastra su un agitatore orbitale per almeno 2 minuti per mescolare completamente i campioni. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Lascia la piastra sul supporto fino a quando il composto diventa trasparente e le palline sono vincolanti pellet. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Aggiungere 100μl soluzione di lavaggio ARNA in ogni pozzetto e agitare la piastra per 1 minuto l&#39;agitatore orbitale a velocità moderata. Perline potrebbero non disperdere in questa fase. </li><li> Spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. </li><li> Con attenzione aspirare il surnatante con un aspiratore a vuoto senza disturbare il sfere magnetiche. In alternativa, rimuovere con attenzione il surnatante con una pipetta e scartare il surnatante. </li><li> Togliere la placca dal supporto magnetico. </li><li> Ripetere il lavaggio per volta 2 <sup>°</sup> con la soluzione di 100μl Wash ARNA. </li><li> Dopo il 2 <sup>°</sup> lavare, asciugare le perle agitando la piastra per 1 minuto l&#39;agitatore orbitale alla massima velocità. Non asciugare eccessivamente i campioni! </li><li> Eluire la ARNA dalle perle con l&#39;aggiunta di 40μl preriscaldato Elution Buffer ARNA per ogni campione. </li><li> Agitare vigorosamente la piastra l&#39;agitatore orbitale per 3 minuti, quindi controllare per assicurarsi che le sfere magnetiche sono completamente disperse. In caso contrario, continuare a tremare. </li><li> Una volta che il sfere magnetiche sono completamente dispersi, spostare la piastra ad un supporto magnetico per catturare le sfere magnetiche. Il supernatante contiene la ARNA ripulito amino-allil incorporato. </li><li> Trasferire accuratamente l&#39;ARNA eluiti ad una nuova piastra PCR (PCR o tubi). </li><li> (Passo opzionale) Controllare la concentrazione di RNA dei campioni misurando 1.5μl su uno spettrofotometro NanoDrop. </li><li> Immediatamente continuare al passaggio successivo, o lasciare il ARNA a -80 ° C. </li></ol><p class="jove_title"> Tabella 1: Mix Strand cDNA 1 <sup>°</sup> master di sintesi </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Reagente</strong> </td><td> <strong>Importo per 1 reazione</strong> </td></tr><tr><td> 10X Buffer Strand Primo </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> Inibitore di ribonucleasi </td><td> 1 ml </td></tr><tr><td> Array Script </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> Tabella 2: Strand cDNA 2 <sup>°</sup> Mix sintesi Maestro </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Reagente</strong> </td><td> <strong>Importo per 1 reazione</strong> </td></tr><tr><td> Acqua priva di nucleasi </td><td> 63 microlitri </td></tr><tr><td> 10X Buffer secondo filone </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> DNA polimerasi </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> RNasi H </td><td> 1 ml </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> Tabella 3: IVT Master Mix </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Reagente</strong> </td><td> <strong>Importo per 1 reazione</strong> </td></tr><tr><td> aaUTP soluzione (75 mm) </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> ATP, CTP, GTP mix (25 mm) </td><td> 12 microlitri </td></tr><tr><td> T7 soluzione UTP (75 mm) </td><td> 2 microlitri </td></tr><tr><td> T7 tampone di reazione 10X </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> T7 Enzyme Mix </td><td> 4 microlitri </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> Tabella 4: Mix ARNA Binding </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Reagente</strong> </td><td> <strong>Importo per 1 reazione</strong> </td></tr><tr><td> Perline RNA Binding * </td><td> 10 microlitri </td></tr><tr><td> Bead Resuspension * Soluzione </td><td> 4 microlitri </td></tr><tr><td> 100% isopropanolo ** </td><td> 6 microlitri </td></tr><tr><td> ARNA Concentrato Binding Buffer </td><td> 50 microlitri </td></tr></tbody></table><p> * Mescolare le perline RNA vincolante con la soluzione di risospensione primo tallone. <br /> ** Aggiungere l&#39;isopropanolo e mescolare bene prima di aggiungere il legame tampone concentrato ARNA. </p>

<ol>
	<li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection:+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes.">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> <em style='font-style: italic'>PLoS ONE</em>. <b>3</b> (7), e2628-e2628 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes.">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci</em>. <b>105</b> (6), 2140-2145 (2008).</li><li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+transcriptome+analysis.">Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E62-E62 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss:+Poxvirus+transcriptome+analysis.">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E63-E64 (2008).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., Mu&#241;oz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells.">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>77</b> (11), 6493-6506 (2003).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells.">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>78</b> (11), 5820-5824 (2004).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., N&#225;jera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC:+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells.">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>80</b> (2), 985-998 (2006).</li><li>Guerra, S., N&#225;jera, J. L., Gonz&#225;lez, J. M., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC.">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> <b>81</b> (16), 8707-8721 (2007).</li></ol>

<p class="jove_content">The authors have nothing to disclose.</p>

<p class="jove_title"> Passaggi critici </p><p class="jove_content"> Un secondo ciclo di amplificazione non è consigliato come pregiudizi nei dati di serie sono stati osservati. Mescolando con cura in ogni fase enzimatica (1 <sup>°</sup> e 2 <sup>°</sup> sintesi filamento cDNA, IVT) è fondamentale per ottenere buoni rendimenti amplificazione, così come di incubazione di ogni passo enzimatica a temperatura adeguata. Un cycler PCR con regolabile coperchio riscaldato si preferisce - deviazioni anche il più piccolo 2-3 gradi durante IVT in un...

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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>AM1753</td>
<td>For 20 reactions</td>
</tr>
<tr>
<td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>AM1821</td>
<td>For 100 reactions, in a 96-well format</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer</td>
<td>Other</td>
<td>NanoDrop</td>
<td>ND-1000</td>
<td>Or equivalent spectrophotometer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 2

<p class="jove_content">La famiglia<em&gt; Poxviridae</em&gt; È costituito da grandi DNA a doppia elica che contiene virus che si replicano esclusivamente nel citoplasma delle cellule infette. I membri del<em&gt; Orthopox</em&gt; Genere includono vaiolo, l&#39;agente eziologico del vaiolo umano, vaiolo delle scimmie, e vaccinico (VAC), il membro prototipo della famiglia di virus. All&#39;interno del relativamente grande (~ 200 kb) vaccinia genoma, tre classi di geni sono codificati: precoce, intermedio e in ritardo. Anche se tutte e tre le classi sono trascritte dai virale codifica RNA polimerasi, ogni classe svolge una funzione diversa nel ciclo di vita del virus. Poxvirus utilizzano strategie multiple di modulare l&#39;ambiente host cellulare durante l&#39;infezione. Per capire regolamentazione sia di accoglienza e di espressione genica del virus, abbiamo utilizzato tutto il genoma approcci per analizzare abbondanza trascrizione sia da virus e cellule ospiti. In questo studio dimostriamo infezioni corso a tempo di cellule HeLa con il virus vaccinico e RNA di campionamento in diversi momenti dopo l&#39;infezione. Sia host e virale RNA totale è isolato e amplificato per l&#39;ibridazione di microarray per l&#39;analisi dell&#39;espressione genica.</p>

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

<p class="jove_content">Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l&#39;espressione genica virale. Parte 2 di 3.</p>

Vaccino infezione da virus e analisi temporale di espressione genica del virus: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

7.9K Views.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. Protocollo per vaccinia infezione di cellule HeLa e analisi di accoglienza e l'espressione genica virale. Parte 2 di 3.