<p class="jove_content"> Whitehead Institute Fellows Fonds </p>

<p class="jove_title"> Partie 1: synthèse de l&#39;ADNc de l&#39;ARN </p><ol><li> Avant d&#39;utiliser le Ambion Amino Allyl MessageAmp II kit, ajouter la quantité recommandée d&#39;éthanol à 100% pour les tampons de lavage. </li><li> Dans le tube de réaction PCR, ajouter entre 100 ng d&#39;ARN total de 5 ug et 1 microlitre de T7 oligo (dT) primer. Porter le volume à 12μl avec une eau sans nucléase. </li><li> Incuber les échantillons à 70 ° C pendant 10 min dans un thermocycleur. </li><li> Retirer les échantillons d&#39;ARN à partir de 70 ° C et centrifuger brièvement. Placez-le sur la glace. </li><li> Préparer le 1 <sup>er</sup> volet de synthèse master mix et de conserver à température ambiante (avec excédent de 10% pour le pipetage d&#39;erreur). <strong>(Tableau 1)</strong> </li><li> Mélanger délicatement la pipette ou feuilleter Maître de mélanger, puis centrifuger brièvement. </li><li> Transfert de l&#39;8μl Master Mix pour chaque échantillon d&#39;ARN. Mélanger par aspiration et refoulement 3-4 fois. </li><li> Incuber à 42 ° C pendant 2 heures dans un thermocycleur. </li><li> Centrifuger les échantillons brièvement et placer sur la glace. Procéder immédiatement à l&#39;étape suivante de la synthèse des ADN double brin. </li><li> Préparer le 2 <sup>ème</sup> volet maîtrise de synthèse mélange sur la glace (avec excédent de 10% pour le pipetage d&#39;erreur). <strong>(Tableau 2)</strong> </li><li> Mélanger délicatement la pipette ou feuilleter Maître de mélanger, puis centrifuger brièvement. </li><li> Transfert 80μl à chaque échantillon et mélanger délicatement par aspiration et refoulement 3-4 fois. </li><li> Incuber à 16 ° C pendant 2 heures dans un thermocycleur. </li><li> Après l&#39;incubation de 2 heures, procéder à l&#39;ADNc de nettoyage étape ou congeler immédiatement à -20 ° C. </li></ol><p class="jove_title"> Partie 2: l&#39;ADNc double brin de nettoyage </p><ol><li> Retirez la pure ADNc du réfrigérateur et le laisser se stabiliser à la température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation. Agitez la bouteille pour bien remettre en suspension les perles magnétiques ADNc contraignante avant l&#39;utilisation. </li><li> Aliquoter eau sans nucléase dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes pendant l&#39;incubation précédentes 2hr. </li><li> Ajouter 180μl de Pure ADNc de chaque échantillon, et bien mélanger par pipetage de haut en bas. Transférer les échantillons à un 96-même à fond rond assiette. </li><li> Continuer à mélanger les échantillons en agitant la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand pendant environ 6 minutes ou jusqu&#39;à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Ajouter 150μl de tampon de lavage d&#39;ADNc dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l&#39;agitateur orbital à vitesse modérée. Perles va se dispersent pas à cette étape, en raison de la faible tension de surface du tampon de lavage. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Répéter le lavage une 2 <sup>ème</sup> fois avec 150μl de tampon de lavage d&#39;ADNc. </li><li> Après le lavage 2 <sup>ème,</sup> sécher les perles en secouant la plaque pendant 2 minutes sur l&#39;agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher! </li><li> Éluer l&#39;ADNc à partir des billes en ajoutant 18μl de l&#39;préchauffé eau sans nucléase à chaque échantillon. </li><li> Secouez vigoureusement la plaque pendant 3 minutes sur l&#39;agitateur orbital, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant. </li><li> Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d&#39;un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. </li><li> Soigneusement transfert de l&#39;ADNc élué (~ 16μl) d&#39;une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR). </li><li> Passez directement à l&#39;étape suivante, ou geler l&#39;ADNc à -20 ° C. </li></ol><p class="jove_title"> Partie 3: <em>transcription</em> in <em>vitro</em> (IVT) </p><ol><li> Préparer le mélange maître IVT à température ambiante. <strong>(Tableau 3)</strong> </li><li> Délicatement la pipette du Master Mix ou à cran de se mélanger, et centrifuger brièvement. </li><li> Ajouter 24μl de chaque échantillon, et mélanger délicatement par aspiration et refoulement 3-4 fois. </li><li> Incuber à 37 ° C pendant 14 heures dans un thermocycleur, puis maintenez à 4 ° C jusqu&#39;au moment de l&#39;étape suivante. </li></ol><p class="jove_title"> Partie 4: ARNa nettoyage après IVT </p><ol><li> Vortex les perles liaison à l&#39;ARN brièvement pour obtenir un mélange homogène avant utilisation. </li><li> Préparer le ARNa Mix reliure à température ambiante <strong>(tableau 4)</strong> Cela peut être fait à l&#39;avance -. Le mélange préparé contraignantes peuvent être stockés à température ambiante pendant jusqu&#39;à une semaine. </li><li> Mélangez bien au vortex. </li><li> Aliquoter le tampon d&#39;élution ARNa dans un tube de 1,5 ml et incuber à 50-60 ° C pendant au moins 10 minutes. </li><li> Ajouter 70μl de l&#39;ARNa mélange de liantà chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois. </li><li> Transférer les échantillons de la plaque PCR de 96 puits à fond rond assiette. </li><li> Ajouter 50 pl de 100% d&#39;isopropanol à chaque échantillon et bien mélanger par pipetage haut et en bas de 3-4 fois. </li><li> Secouez doucement la plaque sur un agitateur orbital pendant au moins 2 minutes pour bien mélanger les échantillons. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Laisser la plaque sur le stand jusqu&#39;à ce que le mélange devient transparent et les perles à caractère contraignant ont granulés. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Ajouter 100 ul Solution Laver ARNa dans chaque puits et agiter la plaque pendant 1 minute sur l&#39;agitateur orbital à vitesse modérée. Perles peut pas entièrement se dispersent à cette étape. </li><li> Déplacer la plaque à un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. </li><li> Aspirer délicatement le surnageant avec un aspirateur sans déranger les billes magnétiques. Sinon, retirez délicatement le surnageant avec une pipette et jeter le surnageant. </li><li> Retirer la plaque du socle magnétique. </li><li> Répétez le laver une fois 2 <sup>ème</sup> avec 100 ul Solution Laver ARNa. </li><li> Après le lavage 2 <sup>ème,</sup> sécher les perles en secouant la plaque pendant 1 minute sur l&#39;agitateur orbital à la vitesse maximale. Ne pas trop sécher les échantillons! </li><li> Eluer la ARNa des billes en ajoutant 40μl de tampon d&#39;élution préchauffé ARNa à chaque échantillon. </li><li> Secouez vigoureusement la plaque sur l&#39;agitateur orbital pendant 3 minutes, puis vérifiez que les billes magnétiques sont totalement dispersés. Sinon, continuez secouant. </li><li> Une fois que les billes magnétiques ont complètement dispersé, déplacer la plaque d&#39;un support magnétique pour capturer les billes magnétiques. Le surnageant contient les ARNa nettoyé aminés allyle incorporé. </li><li> Soigneusement transférer le ARNa élué à une nouvelle plaque PCR (ou tubes PCR). </li><li> (Étape facultative) Vérifiez la concentration en ARN des échantillons en mesurant 1.5μl sur un spectrophotomètre NanoDrop. </li><li> Immédiatement continuer sur la prochaine étape, ou de stocker l&#39;ARNa à -80 ° C. </li></ol><p class="jove_title"> Tableau 1: Volet 1 <sup>er</sup> ADNc Synthèse Mix Master </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Réactifs</strong> </td><td> <strong>Montant pour une réaction</strong> </td></tr><tr><td> Tampon 10X First Strand </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> Inhibiteur de la ribonucléase </td><td> 1 pl </td></tr><tr><td> Script tableau </td><td> 1 pl </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> Tableau 2: ADNc 2 <sup>ème</sup> volet Maître Synthèse Mix </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Réactifs</strong> </td><td> <strong>Montant pour une réaction</strong> </td></tr><tr><td> Eau sans nucléase </td><td> 63 ul </td></tr><tr><td> Tampon 10X deuxième brin </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> ADN polymérase </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> RNase H </td><td> 1 pl </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> Tableau 3: IVT Mix Master </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Réactifs</strong> </td><td> <strong>Montant pour une réaction</strong> </td></tr><tr><td> aaUTP solution (75 mM) </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> ATP, CTP, GTP mélange (25 mM) </td><td> 12 ul </td></tr><tr><td> T7 UTP solution (75 mM) </td><td> 2 pl </td></tr><tr><td> Tampon de réaction 10X T7 </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> T7 Enzyme Mix </td><td> 4 pl </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> Tableau 4: Mélanger ARNa reliure </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Réactifs</strong> </td><td> <strong>Montant pour une réaction</strong> </td></tr><tr><td> Perles liaison à l&#39;ARN * </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> * Remise en suspension de billes Solution </td><td> 4 pl </td></tr><tr><td> 100% d&#39;isopropanol ** </td><td> 6 pl </td></tr><tr><td> Concentré ARNa Binding Buffer </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table><p> * Mélanger les perles liaison à l&#39;ARN avec la solution resuspension premier talon. <br /> ** Ajouter l&#39;isopropanol et bien mélanger avant d&#39;ajouter le concentré de tampon de liaison ARNa. </p>

<ol>
	<li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection:+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes.">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> <em style='font-style: italic'>PLoS ONE</em>. <b>3</b> (7), e2628-e2628 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes.">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci</em>. <b>105</b> (6), 2140-2145 (2008).</li><li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+transcriptome+analysis.">Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E62-E62 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss:+Poxvirus+transcriptome+analysis.">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E63-E64 (2008).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., Mu&#241;oz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells.">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>77</b> (11), 6493-6506 (2003).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells.">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>78</b> (11), 5820-5824 (2004).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., N&#225;jera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC:+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells.">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>80</b> (2), 985-998 (2006).</li><li>Guerra, S., N&#225;jera, J. L., Gonz&#225;lez, J. M., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC.">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> <b>81</b> (16), 8707-8721 (2007).</li></ol>

<p class="jove_content">The authors have nothing to disclose.</p>

<p class="jove_title"> Étapes critiques </p><p class="jove_content"> Un second tour de l&#39;amplification n&#39;est pas conseillé que des biais dans les données array ont été observées. Mélanger soigneusement à chaque étape enzymatique (1 <sup>er</sup> et 2 <sup>ème</sup> synthèse brin d&#39;ADNc, IVT) est essentielle à l&#39;obtention de rendements d&#39;amplification bon, tout comme l&#39;incubation de chaque étape enzymatique à la température appropriée. Un cycleur PCR avec couvercle chauffant réglable est préféré - les ...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
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		<div>
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		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>AM1753</td>
<td>For 20 reactions</td>
</tr>
<tr>
<td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>AM1821</td>
<td>For 100 reactions, in a 96-well format</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer</td>
<td>Other</td>
<td>NanoDrop</td>
<td>ND-1000</td>
<td>Or equivalent spectrophotometer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 2

<p class="jove_content">La famille<em&gt; Poxviridae</em&gt; Se compose de grandes double-brin d&#39;ADN contenant des virus qui se répliquent exclusivement dans le cytoplasme des cellules infectées. Les membres de la<em&gt; Orthopoxvirus</em&gt; Genre comprennent la variole, l&#39;agent causal de la variole humaine, simienne, et la vaccine (ACC), le membre prototypique de la famille des virus. Dans le génome relativement importante (~ 200 ko) de la vaccine, trois classes de gènes sont encodés: précoce, intermédiaire et tardive. Alors que tous les trois classes sont transcrits par les ARN polymérases virale codée, chaque classe a une fonction différente dans le cycle de vie du virus. Les poxvirus utilisent de multiples stratégies pour la modulation de l&#39;environnement cellulaire de l&#39;hôte pendant l&#39;infection. Afin de comprendre la régulation de l&#39;hôte et l&#39;expression des gènes du virus, nous avons utilisé l&#39;échelle du génome des approches pour analyser l&#39;abondance transcription de deux virus et les cellules hôtes. Ici, nous démontrons infections cours du temps des cellules HeLa par le virus de la vaccine et de l&#39;ARN d&#39;échantillonnage à différents moments après l&#39;infection. Les deux hôtes et virales ARN total est isolé et amplifié pour que l&#39;hybridation des puces pour l&#39;analyse de l&#39;expression génique.</p>

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Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

<p class="jove_content">Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l&#39;analyse de l&#39;hôte et l&#39;expression des gènes viraux.</p>

Infection virus de la vaccine et l&#39;analyse temporelle de l&#39;expression des gènes de virus: Partie 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

7.9K vues.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. Protocole pour la vaccine infection de cellules HeLa et l'analyse de l'hôte et l'expression des gènes viraux.