화이트 헤드 연구소 펠로 자금

1 부 : RNA로부터 cDNA 합성 <ol><li> 앰비온 아미노 알릴 MessageAmp II 키트를 사용하기 전에, 세척 버퍼에 100 % 에탄올의 권장 볼륨을 추가합니다. </li><li> PCR 반응 관에서 T7 oligo (DT) 프라이머 총 RNA 및 1μl의 5μg을 100ng 사이를 추가합니다. nuclease 무료 물로 12μl에 볼륨을 가져와. </li><li> 70 샘플을 품어 ° C thermocycler 10 분. </li><li> ° C와 원심 분리기 간략 70 RNA 샘플을 제거합니다. 얼음 놓습니다. </li><li> 1 일 스트랜드 합성 마스터 믹스를 준비하고 (오류 pipetting 10 % 없더군요)를 실온에서 보관. (표 1) </li><li> 부드럽게 피펫 마스터 믹스이나 제스처는 혼합 후 간단히 원심 분리기. </li><li> 각 RNA 샘플을 마스터 믹스 8μl을 전송합니다. 3-4 회를 아래와 pipetting하여 섞는다. </li><li> thermocycler 2 시간 동안 42 ° C에서 알을 품다. </li><li> 얼음 원심 분리기 샘플의 잠시 장소. 즉시 dsDNA 합성의 다음 단계로 진행합니다. </li><li> 얼음 2 차 스트랜드 합성 마스터 믹스 (오류를 pipetting 10 % 없더군요 포함). (표 2)를 준비 </li><li> 부드럽게 피펫 마스터 믹스이나 제스처는 혼합 후 간단히 원심 분리기. </li><li> 각 샘플에 80μl를 전송하고 부드럽게 3-4 회를 아래와 pipetting하여 섞는다. </li><li> thermocycler 2 시간 동안 16 ° C에서 알을 품다. </li><li> 2 시간 부화 후 cDNA 정리 단계로 진행 또는 -20 ° C. 즉시 동결 </li></ol> 2 부 : 두 번 좌초 cDNA 청소 <ol><li> 냉장고에서 cDNA 순수를 제거하고 사용하기 전에 30 분 방 온도로 평형 수 있습니다. 완전히 사용하기 전에 자기 cDNA 바인딩 구슬을 resuspend 수있는 병을 흔들어. </li><li> 1.5mL 튜브와 50-60에서 품어 ° C 이전의 2 시간 배양 기간 동안 적어도 10 분 동안에 나누어지는 nuclease없는 물. </li><li> 각 샘플에 cDNA 순수의 180μl를 추가하고, 철저하게 최대 pipetting 아래로 섞는다. 96 - 잘 왕복 하단 플레이트에 샘플을 전송합니다. </li><li> 부드럽게 최소한 2 분 동안 궤도 쉐이크에 대한 번호판을 흔들어하여 샘플을 섞어 계속합니다. </li><li> 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 약 6 분 동안 증언대에 접시를 남겨 또는 혼합물이 투명하게되고 바인딩 비즈가 pelleted 때까지. </li><li> 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 각 잘하는 150μl cDNA 씻으 버퍼를 추가하고 중간 속도로 궤도 쉐이크에서 1 분 접시를 흔들. 구슬은 세척 버퍼의 낮은 표면 장력으로 인해,이 단계에서 분산 않을 것입니다. </li><li> 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 세차에게 150μl cDNA 씻으 버퍼와 함께 2 차 시간을 반복합니다. </li><li> 2 차 세척 후, 최대 속도로 궤도 쉐이크 2 분 동안 접시를 흔들어하여 비즈를 건조. overdry하지 마! </li><li> 각 샘플에 preheated nuclease없는 물 18μl를 추가하여 비즈에서 cDNA를 Elute. </li><li> 적극적으로 궤도 쉐이크 3 분 동안 접시를 흔들 다음 자성 비즈가 완전히 분산되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않다면, 계속 떨고. </li><li> 자기 비즈가 완전히 분산이되면, 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 (~ 16μl) eluted cDNA는 새로운 PCR 플레이트 (또는 PCR 튜브)로 전송할 수 있습니다. </li><li> 다음 단계로 바로 진행, 또는 -20 ° C.에서 cDNA를 동결 </li></ol> 제 3 부 : 시험 관내 전사의 (IVT) <ol><li> 상온에서 IVT 마스터 섞는다. (표 3) 준비 </li><li> 부드럽게 마스터 믹스 또는 혼합에 영화를 피펫, 그리고 짧게 원심 분리기. </li><li> 각 샘플에 24μl에 추가하고, 부드럽게 3-4 회를 아래와 pipetting하여 섞는다. </li><li> thermocycler 14 시간 동안 37 ° C에서 품어, 다음 단계에 대한 ° C까지 준비 4 만요. </li></ol> 4 부 : 아르나 청소 IVT 후 <ol><li> 소용돌이 RNA 바인딩 비즈 간단히 사용하기 전에도 혼합물을 얻을 수 있습니다. </li><li> 상온에서 아르나 바인딩 믹스를 준비 (표 4) 이것은 미리 할 수 있습니다 -. 준비 바인딩 조합은 최대 일주일 위해 상온에서 저장할 수 있습니다. </li><li> vortexing하여 잘 섞는다. </li><li> 적어도 10 분 동안 50-60 ° C에서 1.5mL 튜브와 부화로 나누어지는 아르나의 용출 버퍼. </li><li> 아르나 바인딩 믹스 70μl를 추가각 샘플과 3-4 회 위아래로 pipetting과로 잘 섞는다. </li><li> PCR 플레이트에서 96 잘 왕복 하단 플레이트에 샘플을 전송합니다. </li><li> 각 샘플에 이소프로판올 100 % 50μl를 추가하고 3-4 회 위아래로 pipetting과로 잘 섞는다. </li><li> 부드럽게 철저하게 샘플을 혼합하기 위해 최소한 2 분 동안 궤도 쉐이크에 접시를 흔들. </li><li> 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 혼합물이 투명하게되고 바인딩 비즈가 pelleted 때까지 법정에 접시를 남겨주세요. </li><li> 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 각 잘하는 100μl 아르나 와시 솔루션을 추가하고 중간 속도로 궤도 쉐이크에서 1 분 접시를 흔들. 구슬 완전히이 단계에서 분산되지 않을 수 있습니다. </li><li> 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. </li><li> 조심스럽게 자기 구슬을 방해하지 않고 진공 흡인기로 뜨는을 대기음. 또는, 조심스럽게 피펫으로 뜨는을 제거하고 표면에 뜨는 폐기하십시오. </li><li> 자석 스탠드에서 플레이트를 제거합니다. </li><li> 세차에게 100μl 아르나 와시 솔루션 2 차 시간을 반복합니다. </li><li> 2 차 세척 후, 최대 속도로 궤도 쉐이크 1 분에 대한 번호판을 흔들어하여 비즈를 건조. 샘플을 overdry하지 마! </li><li> 각 샘플에 40μl preheated 아르나의 용출 버퍼를 추가하여 비즈에서 아르나을 Elute. </li><li> 강력 3 분 궤도 쉐이크에 번호판을 흔들 다음 마그네틱 비즈가 완전히 분산되어 있는지 확인합니다. 그렇지 않다면, 계속 떨고. </li><li> 자기 비즈가 완전히 분산이되면, 자기 구슬을 캡처하는 자기 서서 접시를 이동합니다. 뜨는은 청소 접속 아미노 알릴 통합의 아르나가 포함되어 있습니다. </li><li> 조심스럽게 새로운 PCR 플레이트 (또는 PCR 튜브)로 eluted 아르나를 전송합니다. </li><li> (선택 단계) NanoDrop 분광 광도계에 1.5μl를 측정하여 시료의 RNA 농도를 확인합니다. </li><li> 바로 다음 단계에 계속하거나, -80에서 아르나를 저장 ° C. </li></ol> 표 1 : cDNA 1 일 스트랜드 합성 마스터 믹스 <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 한 반응에 대한 금액 </td></tr><tr><td> 10X 먼저 스트랜드 버퍼 </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> dNTP 믹스 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> Ribonuclease 억제제 </td><td> 1 μl </td></tr><tr><td> 배열 스크립트 </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table> 표 2 : cDNA 2 차 스트랜드 합성 마스터 믹스 <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 한 반응에 대한 금액 </td></tr><tr><td> Nuclease 무료로 물 </td><td> 63 μl </td></tr><tr><td> 10X 둘째 스트랜드 버퍼 </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> dNTP 믹스 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> DNA 효소 </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> RNase H </td><td> 1 μl </td></tr></tbody></table> 표 3 : IVT 마스터 믹스 <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 한 반응에 대한 금액 </td></tr><tr><td> aaUTP 솔루션 (75 ㎜) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> ATP, CTP, GTP 믹스 (25 ㎜) </td><td> 12 μl </td></tr><tr><td> T7 UTP 솔루션 (75 ㎜) </td><td> 2 μl </td></tr><tr><td> T7 10X 반응 완충액 </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> T7 효소 믹스 </td><td> 4 μl </td></tr></tbody></table> 표 4 : 아르나 바인딩 믹스 <table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> 시약 </td><td> 한 반응에 대한 금액 </td></tr><tr><td> RNA 바인딩 비즈 * </td><td> 10 μl </td></tr><tr><td> 비드 Resuspension 솔루션 * </td><td> 4 μl </td></tr><tr><td> 백퍼센트 이소프로판올 ** </td><td> 6 μl </td></tr><tr><td> 아르나 바인딩 버퍼 컨센트레이트 </td><td> 50 μl </td></tr></tbody></table> * 먼저 비드 resuspension 솔루션 RNA 바인딩 비즈를 섞습니다. ** 이소프로판올를 추가하고 아르나 바인딩 버퍼 집중을 추가하기 전에 잘 섞는다.

<ol>
	<li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection:+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes.">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> PLoS ONE. 3 (7), e2628-e2628 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes.">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. 105 (6), 2140-2145 (2008).</li><li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+transcriptome+analysis.">Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E62-E62 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss:+Poxvirus+transcriptome+analysis.">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, E63-E64 (2008).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., Mu&#241;oz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells.">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 77 (11), 6493-6506 (2003).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells.">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> J Virol. 78 (11), 5820-5824 (2004).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., N&#225;jera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC:+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells.">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> J Virol. 80 (2), 985-998 (2006).</li><li>Guerra, S., N&#225;jera, J. L., Gonz&#225;lez, J. M., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC.">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> 81 (16), 8707-8721 (2007).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

중요 단계 배열 데이터에 편견이 관찰되었습니다로서 증폭의 두 번째 라운드는 권장되지 않습니다. 각 효소 단계 (1 일 및 2 차 가닥 cDNA 합성, IVT)에서 신중하게 혼합하는 것은 각 단계의 효소 배양은 적절한 온도는 좋은 증폭 수율을 얻는 것이 중요합니다. 도 편차를 공기 하이브 리다이 제이션 오븐이나 물 목욕 하이브 리다이 제이션에서 IVT 중 2-3 도까지처럼...

<table><tbody><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td><td>Reagent</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1753</td><td>For 20 reactions</td></tr><tr><td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td><td>Reagent</td><td>Applied Biosystems</td><td>AM1821</td><td>For 100 reactions, in a 96-well format</td></tr><tr><td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer</td><td>Other</td><td>NanoDrop</td><td>ND-1000</td><td>Or equivalent spectrophotometer</td></tr></tbody></table>

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 2

가족<em&gt; Poxviridae</em&gt; 감염된 세포의 세포질에서 독점적으로 복제 바이러스를 포함하는 대형 더블 - 좌초된 DNA로 구성되어 있습니다. 회원<em&gt; orthopox</em&gt; 속 포함 천연두, 인간 작은 수두의 원인이되는 대리인, monkeypox, 그리고 우두 (VAC), 바이러스 제품군의 prototypic 회원. 비교적 큰 (~ 2백킬로바이트) 우두 게놈 내에서 유전자의 세 클래스가 인코딩됩니다 : 초기, 중간, 그리고 늦었어요. 세 클래스가 virally 인코딩 RNA의 polymerases에 의해 베꼈는데 있지만, 각 클래스는 바이러스의 생활주기에서 다른 기능을 제공합니다. Poxviruses 감염 동안에 호스트 세포 환경의 변조에 대해 여러 전략을 활용합니다. 두 호스트 및 바이러스 유전자 발현의 조절을 이해하기 위해서, 우리는 바이러스와 호스트 세포 모두에서 사본의 풍요로움을 분석하는 게놈 차원의 접근법을 활용했습니다. 여기서 우리는 몇 시간이 지점 후 감염에 우두 바이러스와 샘플링 RNA와 헬라 세포의 시간 코스 감염을 보여줍니다. 두 호스트 및 바이러스 총 RNA는 격리 및 유전자 발현 분석을 위해 microarrays에 하이브 리다이 제이션에 대한 증폭됩니다.

Watch this Scientific Journal Video about Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2 at JoVE.com

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 2.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 2 부

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

8.0K 조회수.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. 호스트 및 바이러스성 유전자 발현의 헬라 세포 및 분석의 우두 감염 프로토콜. 3 부 2.

비디오: Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in bioterrorism is also a concern. A better understanding of the cellular factors that impact infection would facilitate the development of much-needed therapeutics. Recent advances in RNA interference (RNAi) technology coupled with complete genome sequencing of several organisms has led to the optimization of genome-wide, cell-based loss-of-function screens. Drosophila cells are particularly amenable to genome-scale screens because of the ease and efficiency of RNAi in this system 1. Importantly, a wide variety of viruses can infect Drosophila cells, including a number of mammalian viruses of medical and agricultural importance 2,3,4. Previous RNAi screens in Drosophila have identified host factors that are required for various steps in virus infection including entry, translation and RNA replication 5. Moreover, many of the cellular factors required for viral replication in Drosophila cell culture are also limiting in human cells infected with these viruses 4,6,7,8, 9. Therefore, the identification of host factors co-opted during viral infection presents novel targets for antiviral therapeutics. Here we present a generalized protocol for a high-throughput RNAi screen to identify cellular factors involved in viral infection, using vaccinia virus as an example.

RNAi Screening for Host Factors Involved in Vaccinia Virus Infection using Drosophila Cells

Novel host factors involved in viral infection can be identified through cell-based genome-wide loss of function RNAi screening. A Drosophila cell culture model is particularly amenable to this approach due to the ease and efficiency of RNAi. Here we demonstrate this technique using vaccinia virus as an example.

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두</em사용하기> 바이러스 감염 Drosophila 전지

Viral pathogens represent a significant public health threat; not only can viruses cause natural epidemics of human disease, but their potential use in ...

연구

면역학 및 감염병학

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness of a variety of oncolytic platforms including HSV, Reovirus, and Vaccinia OVs as treatment for cancer are currently underway2-5. One key characteristic of oncolytic viruses is that they can be genetically modified to express reporter transgenes which makes it possible to visualize the infection of tissues by microscopy or bio-luminescence imaging6,7. This offers a unique advantage since it is possible to infect tissues from patients ex vivo prior to therapy in order to ascertain the likelihood of successful oncolytic virotherapy8. To this end, it is critical to appropriately sample tissue to compensate for tissue heterogeneity and assess tissue viability, particularly prior to infection9. It is also important to follow viral replication using reporter transgenes if expressed by the oncolytic platform as well as by direct titration of tissues following homogenization in order to discriminate between abortive and productive infection. The object of this protocol is to address these issues and herein describes 1. The sampling and preparation of tumor tissue for cell culture 2. The assessment of tissue viability using the metabolic dye alamar blue 3. Ex vivo infection of cultured tissues with vaccinia virus expressing either GFP or firefly luciferase 4. Detection of transgene expression by fluorescence microscopy or using an In Vivo Imaging System (IVIS) 5. Quantification of virus by plaque assay. This comprehensive method presents several advantages including ease of tissue processing, compensation for tissue heterogeneity, control of tissue viability, and discrimination between abortive infection and bone fide viral replication.

Ex Vivo Infection of Live Tissue with Oncolytic Viruses

Oncolytic viruses are promising for cancer therapeutics. The ability to ascertain the infectability of live tissue specimens obtained from patients prior to treatment is a unique advantage of this therapeutic approach. This protocol describes how to process tissues for ex vivo infection with oncolytic virus and subsequent viral quantification.

Oncolytic 바이러스 살아있는 조직의 전의 VIVO 감염

Oncolytic Viruses (OVs) are novel therapeutics that selectively replicate in and kill tumor cells1. Several clinical trials evaluating the effectiveness ...

의학

Measurement of &#947;HV68 Infection in Mice

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human &gamma;-HVs, such as EBV and KSHV, has severely hindered detailed pathogenic studies. Murine &gamma;-herpesvirus 68 (&gamma;HV68) shares extensive genetic and biological similarities with human &gamma;-HVs and is a natural pathogen of murid rodents2. As such, evaluation of &gamma;HV68 infection of mice inbred strains at different stages of viral infection provides an important model for understanding viral lifecycle and pathogenesis during &gamma;-HVs infection.
Upon intranasal inoculation, &gamma;HV68 infection results in acute viremia in the lung that is later resolved into a latent infection of splenocytes and other cells, which may be reactivated throughout the life of the host3,4. In this protocol, we will describe how to use the plaque assay to assess infectious virus titer in the lung homogenates on Vero cell monolayers at the early stage (5 - 7 days) of post-intranasal infection (dpi). While acute infection is largely cleared 2 - 3 weeks postinfection, a latent infection of &gamma;HV68 is established around 14 dpi and maintained later on in the spleen of the mice. Latent infection usually affects a very small population of cells in the infected tissues, whereby the virus stays dormant and shuts off most of its gene expression. Latently-infected splenocytes spontaneously reactivate virus upon explanting into tissue culture, which can be recapitulated by an infectious center (IC) assay to determine the viral latent load. To further estimate the amount of viral genome copies in the acutely and/or latently infected tissues, quantitative real-time PCR (qPCR) is used for its maximal sensitivity and accuracy. The combined analyses of the results of qPCR and plaque assay, and/or IC assay will reveal the spatiotemporal profiles of viral replication and infectivity in vivo.

&#947;-Herpesviruses (&#947;-HVs) establish life-long persistency in their host. Infection of mice with &#947;-HV68 provides a genetically tractable in vivo model for the characterization of the lifecycle/pathogenesis of &#947;HVs. This protocol describes the detection and quantitation of &#947;HV68 infection at acute and latent stages following infection by plaque-forming, infectious center, and qPCR assays.

마우스에 γHV68 감염의 측정

&gamma;-Herpesviruses (&gamma;-HVs) are notable for their ability to establish latent infections of lymphoid cells1. The narrow host range of human ...

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells. Members of the orthopox genus include variola, the causative agent of human small pox, monkeypox, and vaccinia (VAC), the prototypic member of the virus family. Within the relatively large (~ 200 kb) vaccinia genome, three classes of genes are encoded: early, intermediate, and late. While all three classes are transcribed by virally-encoded RNA polymerases, each class serves a different function in the life cycle of the virus. Poxviruses utilize multiple strategies for modulation of the host cellular environment during infection. In order to understand regulation of both host and virus gene expression, we have utilized genome-wide approaches to analyze transcript abundance from both virus and host cells. Here, we demonstrate time course infections of HeLa cells with Vaccinia virus and sampling RNA at several time points post-infection. Both host and viral total RNA is isolated and amplified for hybridization to microarrays for analysis of gene expression.

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 1

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 1 of 3.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부

생물학

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 3

Protocol for Vaccinia infection of HeLa cells and analysis of host and viral gene expression. Part 3 describes the process of fluorescently labeling the amplified RNA from both host and viral samples by amino allyl coupling of dyes. Part 3 of 3.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 제 3

Viral Tracing of Genetically Defined Neural Circuitry

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus (RABV), and more recently vesicular stomatitis virus (VSV), for studying circuitry, is becoming increasingly popular. These higher throughput methods use viruses that transmit between neurons in either the anterograde or retrograde direction.
Recently, a modified RABV for monosynaptic retrograde tracing was developed. (Figure 1A). In this method, the glycoprotein (G) gene is deleted from the viral genome, and resupplied only in targeted neurons. Infection specificity is achieved by substituting a chimeric G, composed of the extracellular domain of the ASLV-A glycoprotein and the cytoplasmic domain of the RABV-G (A/RG), for the normal RABV-G1. This chimeric G specifically infects cells expressing the TVA receptor1. The gene encoding TVA can been delivered by various methods2-8. Following RABV-G infection of a TVA-expressing neuron, the RABV can transmit to other, synaptically connected neurons in a retrograde direction by nature of its own G which was co-delivered with the TVA receptor. This technique labels a relatively large number of inputs (5-10%)2 onto a defined cell type, providing a sampling of all of the inputs onto a defined starter cell type.
We recently modified this technique to use VSV as a transsynaptic tracer9. VSV has several advantages, including the rapidity of gene expression. Here we detail a new viral tracing system using VSV useful for probing microcircuitry with increased resolution. While the original published strategies by Wickersham et al.4 and Beier et al.9 permit labeling of any neurons that project onto initially-infected TVA-expressing-cells, here VSV was engineered to transmit only to TVA-expressing cells (Figure 1B). The virus is first pseudotyped with RABV-G to permit infection of neurons downstream of TVA-expressing neurons. After infecting this first population of cells, the virus released can only infect TVA-expressing cells. Because the transsynaptic viral spread is limited to TVA-expressing cells, presence of absence of connectivity from defined cell types can be explored with high resolution. An experimental flow chart of these experiments is shown in Figure 2. Here we show a model circuit, that of direction-selectivity in the mouse retina. We examine the connectivity of starburst amacrine cells (SACs) to retinal ganglion cells (RGCs).

A method of tracing synaptically connected neurons is described. We use TVA specificity of an upstream cell to probe whether a cell population of interest receives synaptic input from genetically defined cell types.

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

Classical methods for studying neuronal circuits are fairly low throughput. Transsynaptic viruses, particularly the pseudorabies (PRV) and rabies virus ...

신경과학

Methodology for the Efficient Generation of Fluorescently Tagged Vaccinia Virus Proteins

Tagging of viral proteins with fluorescent proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding of virus-host interactions. Vaccinia virus (VACV), the live vaccine used in the eradication of smallpox, is particularly amenable to fluorescent live-cell microscopy owing to its large virion size and the ease with which it can be engineered at the genome level. We report here an optimized protocol for generating recombinant viruses. The minimal requirements for targeted homologous recombination during vaccinia replication were determined, which allows the simplification of construct generation. This enabled the alliance of transient dominant selection (TDS) with a fluorescent reporter and metabolic selection to provide a rapid and modular approach to fluorescently label viral proteins. By streamlining the generation of fluorescent recombinant viruses, we are able to facilitate downstream applications such as advanced imaging analysis of many aspects of the virus-host interplay that occurs during virus replication.

A rapid and modular protocol for the generation of recombinant vaccinia viruses expressing fluorescently&#160;tagged proteins simultaneously using the method of transient dominant selection is described here.

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

Tagging of viral proteins with fluorescent  proteins has proven an indispensable approach to furthering our understanding  of virus-host interactions. ...

Vaccinia Reporter Viruses for Quantifying Viral Function at All Stages of Gene Expression

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. The family also includes the smallpox virus, Variola. Due to the complexity of poxvirus replication, many questions still remain regarding their gene expression strategy. In this article we describe the conceptualization and usage of recombinant vaccinia viruses that enable real-time measurement of single and multiple stages of viral gene expression in a high-throughput format. This is enabled through the use of spectrally distinct fluorescent proteins as reporters for each of three stages of viral replication. These viruses provide a high signal-to-noise ratio while retaining stage specific expression patterns, enabling plate-based assays and microscopic observations of virus propagation and replication. These tools have uses for antiviral discovery, studies of the virus-host interaction, and evolutionary biology.

We describe the usage of a fluorescent reporter vaccinia virus that enables real-time measurement of viral infectivity and gene expression through the stage-specific expression of spectrally distinct reporter fluorophores. We detail a plate-based method for accurately identifying the stage at which virus replication is affected in response to small molecule inhibition.

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

Poxviruses are a family of double stranded DNA viruses that include active human pathogens such as monkeypox, molluscum contagiousum, and Contagalo virus. ...

Arbovirus Infections As Screening Tools for the Identification of Viral Immunomodulators and Host Antiviral Factors

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. However, these screens are typically conducted in cells that are naturally permissive to the viral pathogen under study. Therefore, the robust replication of viruses in control conditions may limit the dynamic range of these screens. Furthermore, these screens may be unable to easily identify cellular defense pathways that restrict virus replication if the virus is well-adapted to the host and capable of countering antiviral defenses. In this article, we describe a new paradigm for exploring virus-host interactions through the use of screens that center on naturally abortive infections by arboviruses such as vesicular stomatitis virus (VSV). Despite the ability of VSV to replicate in a wide range of dipteran insect and mammalian hosts, VSV undergoes a post-entry, abortive infection in a variety of cell lines derived from lepidopteran insects, such as the gypsy moth (Lymantria dispar). However, these abortive VSV infections can be &#34;rescued&#34; when host cell antiviral defenses are compromised. We describe how VSV strains encoding convenient reporter genes and restrictive L. dispar cell lines can be paired to set-up screens to identify host factors involved in arbovirus restriction. Furthermore, we also show the utility of these screening tools in the identification of virally encoded factors that rescue VSV replication during coinfection or through ectopic expression, including those encoded by mammalian viruses. The natural restriction of VSV replication in L. dispar cells provides a high signal-to-noise ratio when screening for the conditions that promote VSV rescue, thus enabling the use of simplistic luminescence- and fluorescence-based assays to monitor the changes in VSV replication. These methodologies are valuable for understanding the interplay between host antiviral responses and viral immune evasion factors.

Here, we present the protocols to identify 1) virus-encoded immunomodulators that promote arbovirus replication and 2) eukaryotic host factors that restrict arbovirus replication. These fluorescence- and luminescence-based methods allow researchers to rapidly obtain quantitative readouts of arbovirus replication in simplistic assays with low signal-to-noise ratios.

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

RNA interference- and genome editing-based screening platforms have been widely used to identify host cell factors that restrict virus replication. ...

Temporal Analysis of the Nuclear-to-cytoplasmic Translocation of a Herpes Simplex Virus 1 Protein by Immunofluorescent Confocal Microscopy

Infected cell protein 0 (ICP0) of herpes simplex virus 1 (HSV-1) is an immediate early protein containing a RING-type E3 ubiquitin ligase. It is responsible for the proteasomal degradation of host restrictive factors and the subsequent viral gene activation. ICP0 contains a canonical nuclear localization sequence (NLS). It enters the nucleus immediately after de novo synthesis and executes its anti-host defense functions mainly in the nucleus. However, later in infection, ICP0 is found solely in the cytoplasm, suggesting the occurrence of a nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. Presumably ICP0 translocation enables ICP0 to modulate its functions according to its subcellular locations at different infection phases. In order to delineate the biological function and regulatory mechanism of ICP0 nuclear-to-cytoplasmic translocation, we modified an immunofluorescent microscopy method to monitor ICP0 trafficking during HSV-1 infection. This protocol involves immunofluorescent staining, confocal microscope imaging, and nuclear vs. cytoplasmic distribution analysis. The goal of this protocol is to adapt the steady state confocal images taken in a time course into a quantitative documentation of ICP0 movement throughout the lytic infection. We propose that this method can be generalized to quantitatively analyze nuclear vs. cytoplasmic localization of other viral or cellular proteins without involving live imaging technology.

ICP0 undergoes nuclear-to-cytoplasmic translocation during HSV-1 infection. The molecular mechanism of this event is not known. Here we describe the use of confocal microscope as a tool to quantify ICP0 movement in HSV-1 infection, which lays the groundwork for quantitatively analyzing ICP0 translocation in future mechanistic studies.

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 2 부

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두 바이러스 감염 Drosophila* 전지*

Oncolytic 바이러스 살아있는 조직의 전의 VIVO 감염

마우스에 γHV68 감염의 측정

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 제 3

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

Immunofluorescent Confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 2 부

요약

더 많은 비디오 탐색

이 비디오의 챕터

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두 바이러스 감염 Drosophila 전지

Oncolytic 바이러스 살아있는 조직의 전의 VIVO 감염

마우스에 γHV68 감염의 측정

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 1 부

우두 바이러스 감염 및 바이러스 유전자 발현의 시간적 분석 : 제 3

유 전적으로 정의 된 신경 회로의 추적 바이러스

형광 태그 바시니아 바이러스 단백질의 효율적인 생성을위한 방법론

유전자 발현의 모든 단계에서 바이러스 성 기능을 정량화 우두 바이러스 기자

Arbovirus 감염 바이러스 Immunomodulators 및 호스트 항 바이러스 요인의 식별을 위한 도구를 심사로

Immunofluorescent Confocal 현미경 검사 법에 의해 포진 심 플렉스 바이러스 1 단백질의 핵-세포질 전 좌의 시간적 분석

에 관련된 호스트 요인에 대한 RNAi 심사 우두 바이러스 감염 Drosophila* 전지*