<p class="jove_content"> Whitehead Enstitüsü&#39;nden Fellows Fonları </p>

<p class="jove_title"> Bölüm 1: RNA cDNA sentezi </p><ol><li> Ambion Amino Allyl MessageAmp II kiti kullanmadan önce, yıkama tamponlar Önerilen miktar,% 100 etanol ekleyin. </li><li> PCR reaksiyonu tüp, T7 oligo (dT) astar toplam RNA ve 1μl 5μg 100ng arasında ekleyin. Nükleaz içermeyen su ile 12μl hacim kazandırın. </li><li> 70 numune inkübe ° C bir termalcycler 10 dk. </li><li> 70 ° C ve santrifüj kısaca RNA örnekleri çıkarın. Buz üzerine yerleştirin. </li><li> <sup>1.</sup> Strand Sentez ana karışımı hazırlayın ve oda sıcaklığında tutmak (% 10 hata pipetleme tutarı düşmek) <strong>(Tablo 1)</strong> </li><li> Pipet Master Mix veya fiske yavaşça karıştırmak ve ardından kısa bir süre santrifüj. </li><li> Her RNA örnek Master Mix 8μl aktarın. 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme karıştırın. </li><li> PCR 2 saat için 42 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> Santrifüj örnekleri kısaca yer ve buz üzerinde. Hemen dsDNA sentez sonraki adıma geçin. </li><li> Buz üzerinde <sup>2.</sup> Strand Sentez master miks (% 10 hata pipetleme tutarı düşmek) <strong>(Tablo 2)</strong> hazırlayın </li><li> Pipet Master Mix veya fiske yavaşça karıştırmak ve ardından kısa bir süre santrifüj. </li><li> Her bir örnek 80μl aktarın ve hafifçe aşağı yukarı 3-4 kez pipetleme karıştırın. </li><li> PCR 2 saat 16 ° C&#39;de inkübe edin. </li><li> 2 saat inkübasyondan sonra, cDNA temiz-up adım ile devam ya da -20 ° C&#39;de hemen dondurmak </li></ol><p class="jove_title"> Bölüm 2: Çift zincirli cDNA clean-up </p><ol><li> CDNA Saf buzdolabından çıkarın ve kullanmadan önce 30 dakika boyunca oda sıcaklığında gelmesini sağlar. Tam olarak kullanmadan önce, manyetik cDNA bağlayıcı boncuklar tekrar süspansiyon için şişeyi iyice çalkalayınız. </li><li> 1.5mL tüp ve inkübe 50-60 ° C önceki 2saat inkübasyon sırasında en az 10 dakika içine kısım nükleaz içermeyen su. </li><li> Her bir numune için cDNA Saf 180μl ekleyin ve iyice yukarı ve aşağı pipetleme karıştırın. 96-iyi yuvarlak alt plaka örnekleri aktarın. </li><li> Orbital çalkalayıcı plaka en az 2 dakika boyunca hafifçe sallayarak örneklerini karıştırmak için devam edin. </li><li> Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. Yaklaşık 6 dakika boyunca stand plaka bırakın veya karışımı şeffaf hale gelir ve bağlayıcı boncuklar pelet kadar. </li><li> Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> Manyetik stand plaka çıkarın. </li><li> Her iyi 150μl cDNA Yıkama Tampon ekleyin ve 1 dakika boyunca orta hızda orbital çalkalayıcı plaka sallamak. Boncuk yıkama tamponu düşük yüzey gerilimi nedeniyle, bu aşamada dağıtmak ETMEYECEKTIR. </li><li> Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. </li><li> Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> Manyetik stand plaka çıkarın. </li><li> Yıkama 150μl cDNA Yıkama Tampon ile <sup>2.</sup> kez tekrarlayın. </li><li> <sup>2.</sup> yıkamadan sonra, maksimum hızda 2 dakika orbital çalkalayıcı plaka sallayarak boncuk kurulayın. Overdry değil! </li><li> 18μl her numune için, önceden ısıtılmış nükleaz ücretsiz su ekleyerek boncuk cDNA elute. </li><li> Orbital çalkalayıcı 3 dakika plaka şiddetle titremesi, daha sonra manyetik boncuklar tamamen dağılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Aksi takdirde, sarsmaya devam ediyor. </li><li> Manyetik boncuklar tamamen dağınık sonra, manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşımak. </li><li> Dikkatlice yıkandı, cDNA (~ 16μl) yeni bir PCR plaka (ya da PCR tüpleri) aktarmak. </li><li> Doğrudan bir sonraki adıma geçin, ya da -20 ° C&#39;de cDNA dondurmak </li></ol><p class="jove_title"> Bölüm 3: <em>in vitro</em> Transkripsiyon <em>(IVT)</em> </p><ol><li> IVT ana karışımı oda sıcaklığında <strong>(Tablo 3)</strong> hazırlayın </li><li> Master Mix veya karıştırmak için fiske yavaşça pipet, ve kısaca santrifüj. </li><li> Her bir örnek 24μl ekleyin ve hafifçe aşağı yukarı 3-4 kez pipetleme karıştırın. </li><li> Bir termalcycler 14 saat için 37 ° C&#39;de inkübe, daha sonra bir sonraki adıma ° C kadar hazır 4 tutun. </li></ol><p class="jove_title"> Bölüm 4: Arna clean-up IVT sonra </p><ol><li> Vortex RNA bağlayıcı boncuk kısaca kullanmadan önce düzgün bir karışım elde etmek için. </li><li> Oda sıcaklığında Arna Cilt Mix hazırlayın <strong>(Tablo 4)</strong> Bu vaktinden önce yapılabilir. Hazırlanan bağlayıcı karışım, oda sıcaklığında bir haftaya kadar saklanabilir . </li><li> Vorteks ile iyice karıştırın. </li><li> 1.5mL tüp ve en az 10 dakika boyunca 50-60 ° C&#39;de inkübe içine kısım Arna Elüsyon Tampon. </li><li> Arna bağlayıcı karışımı 70μl ekleyinher bir örnek ve aşağı yukarı 3-4 kez pipetleme iyice karıştırın. </li><li> PCR plaka 96-iyi yuvarlak alt plaka örnekleri aktarın. </li><li> Her numune için% 100 izopropanol 50μl 3-4 kez yukarı aşağı pipetleme ekleyin ve iyice karıştırın. </li><li> Yavaşça örnekleri iyice karıştırmak için en az 2 dakika süreyle orbital çalkalayıcı plaka sallayın. </li><li> Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. Karışımı şeffaf hale gelir ve bağlayıcı boncuklar pelet kadar stand plaka bırakın. </li><li> Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> Manyetik stand plaka çıkarın. </li><li> Her iyi 100μl Arna Yıkama Çözeltisi ekleyin ve 1 dakika boyunca orta hızda orbital çalkalayıcı plaka sallamak. Boncuk tam bu aşamada dağıtmayın. </li><li> Manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşıyın. </li><li> Manyetik boncuk rahatsız etmeden dikkatlice bir vakum aspiratör ile süpernatant aspire. Alternatif olarak, bir pipet yardımıyla dikkatlice süpernatant kaldırmak ve supernatant atın. </li><li> Manyetik stand plaka çıkarın. </li><li> Yıkama 100μl Arna Yıkama Çözümü ile <sup>2.</sup> kez tekrarlayın. </li><li> <sup>2.</sup> yıkamadan sonra, maksimum hızda 1 dakika orbital çalkalayıcı plaka sallayarak boncuk kurulayın. Örnekleri overdry etmeyin! </li><li> Her numune için 40μl önceden ısıtılmış Arna Elüsyon Tampon ekleyerek boncuk Arna Zehir. </li><li> 3 dakika orbital çalkalayıcı plaka şiddetle titremesi, daha sonra manyetik boncuklar tamamen dağılmış olduğundan emin olmak için kontrol edin. Aksi takdirde, sarsmaya devam ediyor. </li><li> Manyetik boncuklar tamamen dağınık sonra, manyetik boncuk yakalamak için manyetik bir stand plaka taşımak. Süpernatant temizlenmiş amino alil dahil Arna içerir. </li><li> Yeni bir PCR plaka (ya da PCR tüpleri) dikkatlice yıkandı, Arna aktarın. </li><li> (Opsiyonel adım) NanoDrop spektrofotometre 1.5μl ölçerek örneklerinin RNA konsantrasyonu kontrol edin. </li><li> Hemen bir sonraki adıma üzerine devam eder, ya da -80 Arna saklamak ° C </li></ol><p class="jove_title"> Tablo 1: cDNA <sup>1.</sup> Strand Sentez Master Mix </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Reaktif</strong> </td><td> <strong>1 reaksiyon için Tutarı</strong> </td></tr><tr><td> 10X İlk Strand Tampon </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> Ribonükleaz İnhibitörü </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> Dizi Komut </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> Tablo 2: cDNA <sup>2.</sup> Strand Sentez Master Mix </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Reaktif</strong> </td><td> <strong>1 reaksiyon için Tutarı</strong> </td></tr><tr><td> Nükleazlar ücretsiz su </td><td> 63 ul </td></tr><tr><td> 10X İkinci Strand Tampon </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> dNTP Mix </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> DNA Polimeraz </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> RNaz H </td><td> 1 ul </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> Tablo 3: IVT Master Mix </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Reaktif</strong> </td><td> <strong>1 reaksiyon için Tutarı</strong> </td></tr><tr><td> aaUTP çözümü (75 mM) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> CTP, ATP, GTP mix (25 mM) </td><td> 12 ul </td></tr><tr><td> T7 UTP çözümü (75 mM) </td><td> 2 ul </td></tr><tr><td> T7 10X Reaksiyon Tamponu </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> T7 Enzim Mix </td><td> 4 ul </td></tr></tbody></table><p class="jove_title"> Tablo 4: Arna Bağlama Mix </p><table border="1" cellpadding="8"><tbody><tr><td> <strong>Reaktif</strong> </td><td> <strong>1 reaksiyon için Tutarı</strong> </td></tr><tr><td> RNA Cilt Boncuk * </td><td> 10 ul </td></tr><tr><td> Boncuk Tekrar Süspansiyonu Çözüm * </td><td> 4 ul </td></tr><tr><td> % 100 izopropanol ** </td><td> 6 ul </td></tr><tr><td> Arna Cilt Tampon Konsantre </td><td> 50 ul </td></tr></tbody></table><p> * İlk RNA bağlayıcı boncuk boncuk tabanda çözümü ile karıştırın. <br /> ** Izopropanol Arna bağlayıcı tampon konsantre eklemeden önce ekleyin ve iyice karıştırın. </p>

<ol>
	<li>Rubins, K. H., Hensley, L. E., Bell, G. W., Wang, C., Lefkowitz, E. J., Brown, P. O., Relman, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparative+analysis+of+viral+gene+expression+programs+during+poxvirus+infection:+a+transcriptional+map+of+the+vaccinia+and+monkeypox+genomes.">Comparative analysis of viral gene expression programs during poxvirus infection: a transcriptional map of the vaccinia and monkeypox genomes.</a> <em style='font-style: italic'>PLoS ONE</em>. <b>3</b> (7), e2628-e2628 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinetic+analysis+of+a+complete+poxvirus+transcriptome+reveals+an+immediate-early+class+of+genes.">Kinetic analysis of a complete poxvirus transcriptome reveals an immediate-early class of genes.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci</em>. <b>105</b> (6), 2140-2145 (2008).</li><li>Satheshkumar, P. S., Moss, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Poxvirus+transcriptome+analysis.">Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E62-E62 (2008).</li><li>Assarsson, E., Greenbaum, J. A., Sundstr&#246;m, M., Schaffer, L., Hammond, J. A., Pasquetto, V., Oseroff, C., Hendrickson, R. C., Lefkowitz, E. J., Tscharke, D. C., Sidney, J., Grey, H. M., Head, S. R., Peters, B., Sette, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A.+Reply+to+Satheshkumar+and+Moss:+Poxvirus+transcriptome+analysis.">A. Reply to Satheshkumar and Moss: Poxvirus transcriptome analysis.</a> <em style='font-style: italic'>Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A</em>. <b>105</b>, E63-E64 (2008).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., Mu&#241;oz, M., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+gene+expression+survey+of+vaccinia+virus+infection+of+human+HeLa+cells.">Cellular gene expression survey of vaccinia virus infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>77</b> (11), 6493-6506 (2003).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Conde, R., Pascual-Montano, A., Harshman, K., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microarray+analysis+reveals+characteristic+changes+of+host+cell+gene+expression+in+response+to+attenuated+modified+vaccinia+virus+Ankara+infection+of+human+HeLa+cells.">Microarray analysis reveals characteristic changes of host cell gene expression in response to attenuated modified vaccinia virus Ankara infection of human HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>78</b> (11), 5820-5824 (2004).</li><li>Guerra, S., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Pascual-Montano, A., N&#225;jera, J. L., Zaballos, A., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host+response+to+the+attenuated+poxvirus+vector+NYVAC:+upregulation+of+apoptotic+genes+and+NF-kappaB-responsive+genes+in+infected+HeLa+cells.">Host response to the attenuated poxvirus vector NYVAC: upregulation of apoptotic genes and NF-kappaB-responsive genes in infected HeLa cells.</a> <em style='font-style: italic'>J Virol</em>. <b>80</b> (2), 985-998 (2006).</li><li>Guerra, S., N&#225;jera, J. L., Gonz&#225;lez, J. M., L&#243;pez-Fern&#225;ndez, L. A., Climent, N., Gatell, J. M., Gallart, T., Esteban, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+gene+expression+profiling+after+infection+of+immature+human+monocyte-derived+dendritic+cells+by+the+attenuated+poxvirus+vectors+MVA+and+NYVAC.">Distinct gene expression profiling after infection of immature human monocyte-derived dendritic cells by the attenuated poxvirus vectors MVA and NYVAC.</a> <b>81</b> (16), 8707-8721 (2007).</li></ol>

<p class="jove_content">The authors have nothing to disclose.</p>

<p class="jove_title"> Kritik Adımlar </p><p class="jove_content"> Dizi veri önyargıları gözlenmiştir olarak ikinci bir tur amplifikasyon tavsiye edilmez. <sup>(1.</sup> ve <sup>2.</sup> iplikçik cDNA sentezi, IVT) enzimatik her adım dikkatle Karıştırma her enzimatik adım inkübasyon uygun sıcaklık, iyi amplifikasyon verimi elde etmek için kritik öneme sahiptir. IVT sırasında 2-3 derece bir hava hibridizasyon fırın veya su banyosu hibridizasyon gibi küçük amplifiye ürün verimi önemli ölçüde etkileyebilir bile sapmal...

<!DOCTYPE html PUBLIC "-//W3C//DTD XHTML 1.0 Transitional//EN" "http://www.w3.org/TR/xhtml1/DTD/xhtml1-transitional.dtd">
<html xmlns="http://www.w3.org/1999/xhtml" xml:lang="en" lang="en">	
		
		<div>
		<table border="1">
		<thead>
		<tr>
		<th>Material Name</th>
		<th>Type</th>
		<th>Company</th>
		<th>Catalogue Number</th>
		<th>Comment</th>
		</tr>
		</thead>
		<tbody>
		
<tr>
<td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>AM1753</td>
<td>For 20 reactions</td>
</tr>
<tr>
<td>Amino Allyl MessageAmp II aRNA amplification kit</td>
<td>Reagent</td>
<td>Applied Biosystems</td>
<td>AM1821</td>
<td>For 100 reactions, in a 96-well format</td>
</tr>
<tr>
<td>NanoDrop ND-1000 UV-VIS spectrophotometer</td>
<td>Other</td>
<td>NanoDrop</td>
<td>ND-1000</td>
<td>Or equivalent spectrophotometer</td>
</tr>		</tbody>
		</table>
		</div>
	

vaccinia virus infection &amp; temporal analysis of virus gene expression: part 2

Watch this Scientific Journal Video about Vaccinia Virus Infection & Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2 at JoVE.com

Vaccinia Virus Infection &amp; Temporal Analysis of Virus Gene Expression: Part 2

<p class="jove_content">Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. 3 Bölüm 2</p>

Vaccinia Virüs Enfeksiyonu &amp; Virus Gen İfadesi Zamansal Analizi: Part 2

The family Poxviridae consists of large double-stranded DNA containing viruses that replicate exclusively in the cytoplasm of infected cells.  Members of ...

vaccinia-virus-infection-temporal-analysis-virus-gene-expression-part

Research

JoVE Journal

Biology

7.9K Görüntüleme.  MIT - Massachusetts Institute of Technology. Vaccinia enfeksiyonu HeLa hücrelerinde ve host ve viral gen ekspresyon analizi için protokol. 3 Bölüm 2