首先，将 200 微升体积的 10， 000 个肝细胞癌细胞接种到 96 孔板中，加入 DMEM 和 10%FBS。将细胞在37摄氏度的加湿培养箱中孵育过夜，浓度为5%二氧化碳。第二天，更换培养基并用不同浓度的过氧化氢和甲萘醌处理细胞。
将五毫克DHE溶解在一毫升DMSO中。对于工作溶液，用预热的DMEM培养基将100微摩尔等分试样稀释至10微摩尔浓度。将工作染料溶液涡旋 5 到 10 秒，以确保正确混合。
现在，在静置癌细胞之前，从每个孔中取出测试培养基。然后用PBS轻轻清洗每个孔。将100微升工作染料溶液移液到每个孔中。
将板在 37 摄氏度下孵育 30 分钟。从每个孔中取出含有DHE的培养基。使用多通道移液器用PBS清洗每个孔三次。
现在，将 200 微升含有 Hoechst 33342 核染色染料的 PBS 移液到每个孔中。孵育后，将板转移到高内涵筛选平台。启动 Cellomics CX7 高内涵筛选软件。
根据制造商的规格校准成像平台。在仪器数据库中打开特定于板品牌的系统参数。接下来，小心地将装有样品的板放在成像系统的加热台上。
确保板位置牢固且方向正确。然后轻轻按压微孔板，确保其平放在载物台上。板正确定位后，按住 Control 键。
然后单击“控制”（Control） 和“确定”（OK） 以打开“板加载/卸载”（Plate Load/Unload） 对话框。要选择成像参数，请在 Cellomics BioApplications 界面中打开靶标激活模式。创建与核染色和DHE荧光探针兼容的双通道数据采集新方案。
接下来，指定图像采集所需的物镜，然后选择合适的放大倍率。现在指定曝光时间、相机弯曲和 z 堆叠间隔。设置成像参数后，使用仪器中的不同算法识别感兴趣的主要跟踪对象。
分割已识别的物体后，根据每种细胞类型特有的特定大小、形状和强度参数验证主要物体。定义对象周围的感兴趣区域，并在其周围设置一个 20 微米的圆圈。单击“群体表征”选项卡，然后将扫描限制设置为每孔 1000 个细胞，每个字段至少 10 个对象。
现在单击“启动视图”以扫描每个孔板。然后启动视图分析软件，以CSV格式导出定量数据参数，以进行其他分析。过氧化物暴露导致所有细胞系的ROS诱导荧光以剂量依赖性方式在统计学上显着增加。
使用甲萘醌时，JHH-4细胞的荧光强度呈剂量依赖性增加。然而，仅在其他两种细胞系中观察到较高浓度的荧光差异。
