重组AAV的FPLC纯化与表征

首先，准备 FPLC 系统进行纯化。使用手动说明或定制方法，用无菌超纯水彻底冲洗液体流路。连接 1 毫升预填充肝素柱。

调整压力报警器。并以每分钟一毫升的流速用五柱体积的超纯水洗涤。然后切换系统泵的解决方案，为样品应用做准备。

用缓冲液 B 清洗系统泵 B，并用缓冲液 A 填充剩余的液体流路。将样品泵的样品管插入病毒制剂中。或者，对样品使用超级循环。将出口管插入新容器中。

首次执行纯化时，定义自定义的自动纯化方法。启用常规纯化设置后，该方法将用样品溶液灌注从样品入口 S1 到进样阀的流路。然后使用 12.5% 的缓冲液 B 以每分钟 1 毫升的速率平衡总共 5 个柱体积的色谱柱。

将样品以每分钟 0.5 毫升的速度施加到色谱柱中，并使用出口收集流量。用 20 柱体积的缓冲液 A 以每分钟 1 毫升的速度洗涤色谱柱。然后使用该方案以每分钟一毫升的速度洗脱样品。

选择使用馏分收集器以一毫升馏分收集洗脱的样品。然后用 12.5% 的缓冲液 B 以每分钟 1 毫升的速度重新平衡色谱柱，获得 5 个色谱柱体积。打开创建的方法并等待洗脱步骤。

使用馏分收集器收集馏分。此外，收集流出的等分试样并将馏分储存在零下 20 摄氏度。评估自动保存的所有纯化步骤的色谱图。

包括洗脱曲线。完成后，将入口从缓冲溶液切换到超纯水，并以每分钟 1 毫升的速度洗涤色谱柱，共 5 个色谱柱体积。恢复色谱柱，将进样口从超纯水切换到 20% 乙醇，并洗涤色谱柱 5 个柱体积。

为了浓缩 rAAV，将所需的 FPLC 馏分加载到具有 100 千道尔顿截留分子量的 15 毫升离心过滤装置中。在室温下以 2， 000 G 离心两分钟，以达到约 500 微升的浓缩体积。通过向离心过滤装置中加入一毫升无菌 PBS 继续进行缓冲液置换。

通过移液清洗过滤器。并以一分钟的间隔离心，直到达到 500 微升的体积。通过将此 500 微升样品转移到具有 100 千道尔顿截止值的 0.5 毫升离心过滤装置中，进一步浓缩 rAAV。

并以 6， 000 G 离心一分钟的间隔，直到体积小于 100 微升。通过将过滤装置倒置到新的微量离心管中，然后离心以将 rAAV 转移到管中来回收浓缩的 rAAV。将 rAAV 分装到低保留微量离心管中，并在零下 80 摄氏度下储存。

使用SDS页面分析rAAV制剂的纯度，揭示了不同的衣壳蛋白条带。通过透射电镜对病毒颗粒的可视化显示空颗粒，具有电子致密中心和完整的颗粒。使用stunner平台评估rAAVs的物理杂质特性，揭示了30纳米左右的完整衣壳颗粒、总衣壳滴度、游离和聚集蛋白以及单链DNA。

神经 2a 细胞的感染性测定显示感染性水平高。证实了感染病毒制剂的原代神经元培养物。保留基因转移特性。

用rAAV载体对小鼠小脑进行体内转导导致GFP表达延长。表明在哺乳动物大脑中成功的转基因表达。