作者想感谢的援助，在发展中国家这种模式Verlene亨利和Lindsay霍尔姆斯。这项工作是部分资金由詹姆斯S麦克唐纳基金会（＃220020173）。

1。细胞系<ol><li>在大型组织，辅以5％胎牛血清（FBS），DMEM - F12文化烧瓶的U87MG胶质瘤细胞培养。 </li><li>细胞是由磷酸用温水冲洗烧瓶两次收获缓冲液（PBS）和孵化，在37 ° C时5分钟10毫升的PBS，含0.25％胰蛋白酶和0.05％EDTA。一旦细胞被取消，他们是文化传媒和离心（4分钟）300 X克含10毫升到50毫升的管。 </li><li>洗净后，细胞悬浮在浓度为10 × 10 6 /毫升培养基，允许50,000个细胞/ 5μL接种。 </li><li>细胞被保存在冰直到颅内注射。 </li></ol> 2。丝杠颅内抽薹 此过程可进行数天前的细胞注射。这里描述的所有程序已经进行了严格的无菌条件下。 <ol><li>编号小鼠（BALB / C NU / NU女性; 5-6周;约18克）是用于识别目的，称重并与腹腔注射氯胺酮（100毫克/公斤）和甲苯噻嗪（5毫克的混合物（IP）的anesthetised /公斤）。 </li><li>碘溶液擦拭皮肤，沿中线和前双耳线右侧小切口（2-3毫米）。这暴露颅骨冠状面和矢状面的缝合。前囟门是定位在这两个缝线交界处。 </li><li>丝杠的切入点，然后标记在一个点上侧2.5毫米和1毫米前的前囟。这点是位于正上方的尾状核1。 </li><li> 1 × 1毫米的深孔钻举行麻花钻硬脑膜通过头骨无菌手。 </li><li>成孔，用螺丝刀将延长到硬脑膜的头骨表面以下 1.6毫米的消毒丝杠然后狂奔，直到冲洗的头骨（图1A ）。 </li><li>无菌钢丝或螺丝假人，然后放置到丝杠的中心孔关闭开幕（图1B）。 </li><li> Vetbond组织粘合剂（N -氰基丙烯酸正丁酯）和小鼠封闭伤口reversine腹腔注射液（小动物）（0.1毫升/公斤）和卡洛芬镇痛（5 mg/kg/100μL）。小鼠变暖垫（36℃），这可能需要长达20分钟，然后让其恢复。老鼠经常在此期间恢复时间的监测和观察，直至他们完全清醒。 </li></ol> 3。颅内细胞植入<ol><li>无菌铐汉密尔顿注射器准备用一个小塑料环，只允许2毫米的针头，针头，延长丝杠插座（图1B）以下。最后的接种点，因此颅骨表面下3.5毫米。 </li><li>丝杠手术后四天，老鼠再次麻醉上述（2.1）和小切口是在丝杠删除的钢丝。 </li><li> 5μL以及采取预防措施，不能创造或制定任何气泡混合细胞充满铐汉密尔顿注射器。 </li><li>固定灌注泵注射器和针头插入到丝杠（图1C）。细胞，然后注入每小时30μL的速度。 </li><li>自动化设备（图1D）允许我们在一个恒定的流量的时候，注入10只动物。细胞也可手动注射，所使用的手铐汉密尔顿注射器或注射器可以由200μL枪头已3毫米修剪，使针尖延长2毫米，超出丝杠铐。注入，然后必须在一个恒定的稳健的步伐。 </li><li>当输液完成后，小心取下注射器和钢丝更换成丝杠。封闭伤口粘和小鼠前（2.7）恢复的药物，并允许恢复变暖垫。 </li></ol> 4。治疗的挑战<ol><li> 4天的U87MG细胞接种后，小鼠称重，随机分为对照组和治疗组。 </li><li>对照组给予PBS（100μL）腹腔（IP）的注射，而治疗组给予AMG102（100微克，在100μL的PBS）的IP注射。 </li><li>重复注射每隔一天为14天，共6注射（图2）。 </li><li>最后的注射后，老鼠每天监测和权衡每隔一天。 </li><li>当小鼠开始显示显著的神经功能障碍（平衡紊乱，瘫痪），脱水，或超过10％的重量损失或垂死的，他们被人道人道毁灭。这些人性化的终点天，然后记录Kaplan - Meier生存曲线。 </li></ol> 5。治疗效率的评价</p&gt; <ol><li> Kaplan - Meier生存曲线生成使用GraphPad棱镜4.03为Windows; GraphPad软件，圣地亚哥美国加利福尼亚州， <a href="http://www.graphpad.com">www.graphpad.com</a> 3。死亡或euthanizations标记为终点事件，得分为1。在实验结束后还活着的动物仍然被作为非活动记录，得分为0。 </li></ol> 6。代表性的成果： 控制动物开始后显示的初始接种细胞，神经系统紊乱和减肥23天的迹象。这是在35天的AMG102组显着延迟。事实上，35天，77％（N = 7 / 9），对照组已安乐死。 Kaplan - Meier生存曲线清楚地表明AMG102治疗（图3）的存活率显着增加。 70天，对照组小鼠的88％已被实施安乐死（N = 8 / 9）相比，37％（N = 3 / 8）AMG102治疗组。大脑的组织学分析证实，在对照组的全部9个动物开发的肿瘤相比，只有8 AMG102治疗的小鼠（图4）3。 <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig1.jpg" /> 图1：图像（a）显示在上方位于尾状核的区域定位颅内丝杠。铐汉密尔顿注射器（与细胞预装），然后放置内丝杠2毫米的针头，使超出指导和尾状核细胞内注入3.5毫米。注射器后取出，取而代之的是一个钢丝（二）。自动输液器（C）可以注入10只动物在同一时间。这里展示的是五（四）同时注射。 <img alt="图2" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig2.jpg" /> 图2：原理的研究协议。 0天细胞注射治疗第4天开始。对照组动物注射PBS（100μL）的IP，而治疗组接受注射的AMG102（100μg/100μL）IP。这些注射，每隔一天为10天。一共有6次注射。动物被监测的70天的神经系统和物理扰动的迹象。 <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig3.jpg" /> 图3：Kaplan - Meier生存曲线比较控制和治疗的小鼠AMG102。 AMG102（P = 0.005），治疗后获得显著的生存。 <img alt="图4" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig4.jpg" /> 图4：显微冠状脑肿瘤的发展，在控制动物（一）在AMG102治疗的动物和无脑肿瘤的发展（二）部分展示。比例尺为1毫米。

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这项工作是支持由安进公司从一个研究资助

这里介绍的方法，使颅内丝杠快速，重现性颅内移植瘤的建立和一个受过训练的动物技术人员手中，这个过程是很容易没有立体定向设备的需要的情况下进行。我们的方法结合使用一个丝杠，准确地找到最适合在体内肿瘤的发展的大脑区域，并自动输液泵，允许多达10只动物同时接种一次。丝杠隆胸过程只需不到5分钟执行。细胞在30μL/小时的自动输液需要5μL体积仅有10分钟。这将确保以恒定速率准确的剂量和减少额外的颅区，由于颅内压增高的细胞被驱逐的风险。 10μL卷，我们也执行此过程，并没有观察到任何额外的颅内肿瘤的生长，由于细胞回流。至于自动输液泵还允许几种动物同时接种，我们可以注入高达每小时60动物相比，一个立体的过程，是有限的，以每小时约15％的动物。 在此过程中最关键的一步是在颅骨的指导螺丝的位置，作为它的位置决定了肿瘤体积的最终位置。如果丝杠过中央，细胞会被注入到地区之间的两个大脑半球，而如果引导有条件向前，细胞将不会被注入到大脑的。因此，必须在尽可能准确定位指南2.5毫米的横向和1毫米，前囟 1 。在这项研究中，我们使用了钢丝杠，虽然塑料导向螺钉也可用于这些研究需要脑成像如MRI或PET 6 。即使自动输液泵的成本对某些群体望而却步，细胞仍然可以被注入速度比手动更立体定向的方法。总体而言，这种快速，准确，重现性的方法可用于研究脑胶质瘤，髓母细胞瘤和脑干肿瘤 7 。我们两国之间由于意外麻醉反应（&lt;1％）死亡的实验室，超过500只已执行此过程。小鼠，狂奔与丝杠，并随后注入与细胞没有死亡或遭受任何神经系统并发症，作为一个过程的结果。动物存活过去的100天，无任何并发症。虽然我们倾向于使用像头发的SCID一个无毛小鼠，免疫能力受损的老鼠会一样，适当提供头骨头发前去除手术，以保持工地清洁，防止头发干扰丝杠。 有几个为脑胶质瘤8-10的治疗目前正在制订的新疗法。最近，我们发现，皮下的U87MG胶质瘤异种移植可以治疗AMG102 3的抑制作用;向肝细胞生长因子，目前正在进行5胶质瘤临床评价一个人源化抗体。我们所采用的方法在这里描述的，建立在裸小鼠的大脑颅内的U87MG肿瘤。我们的研究清楚地表明该方法的实用工具和演示，AMG102显著抑制原位的U87MG移植瘤的生长。我们将继续使用这个模型来确定与AMG102可使用其他疗法相结合，以获得更有效地抑制肿瘤生长。

<table border="1"><tbody><tr><th>试剂名称</th><th>公司</th><th>目录编号</th><th>评论（可选） </th></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen公司</td><td> 12634010 </td><td></td></tr><tr><td> FCS的</td><td> Bovogen </td><td> SFB的</td><td></td></tr><tr><td>胰蛋白酶</td><td> Invitrogen公司</td><td> 15050065 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA的</td><td>西格玛</td><td> E6758 </td><td></td></tr><tr><td> BALB / C NU / nu小鼠</td><td> ARC珀斯</td><td></td><td></td></tr><tr><td>螺丝座</td><td>塑料之一</td><td> SD - 1 </td><td></td></tr><tr><td>钻架</td><td>塑料之一</td><td> DH - 1 </td><td></td></tr><tr><td>钻头</td><td>塑料之一</td><td> D＃60 </td><td></td></tr><tr><td>螺杆指南（金属） </td><td>塑料之一</td><td> C212SG </td><td></td></tr><tr><td>螺杆假人（针式） </td><td>塑料之一</td><td> C212SD </td><td></td></tr><tr><td>汉密尔顿注射器（10μL26克凝成针） </td><td>宏力科探索科学</td><td> 80075 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 22/2000输液泵</td><td>哈佛仪器</td><td> 70-2003 </td><td>可选</td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td>热垫</td><td>哈佛仪器</td><td> 340390 </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice

人类肿瘤细胞移植到免疫抑制小鼠的大脑的脑肿瘤，包括胶质母细胞瘤（神经胶质瘤）和髓母细胞瘤的研究建立的方法。广泛应用于立体定向的方法只允许注射一次一个单一的动物，是劳动密集型的，需要高度专业化的设备。丝杠的方法，最初由拉尔等人，1开发的开发，以消除繁琐的立体程序。我们现在介绍一个修改后的丝杠的方法，是迅速的和极其安全;这两者都是重要的伦理方面的考虑。值得注意的是，现在我们的程序采用输液泵，允许多达10个同时与肿瘤细胞注入动物。 为了演示此过程中的效用，我们确立了颅内移植瘤小鼠，然后用AMG102治疗人类的U87MG胶质瘤细胞向肝细胞生长因子/分散因子，目前正在进行临床评价2-5的完全人类抗体。全身注射的AMG102显著延长所有颅内U87MG移植瘤小鼠的生存，并导致一个完整的治疗方法。 这项研究表明，丝杠方法是一种廉价的，高度重现建立颅内移植瘤的方法。此外，它提供了一个用于验证新的治疗策略，治疗脑癌的有关的生理模型。

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A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

为了评估新的治疗脑胶质瘤的治疗范式，生理相关的模型是必不可少的。颅内移植瘤模型的建立，是比立体定向的方法更快速，更安全，我们利用一个植入式丝杠程序。

一个简单的指南螺杆颅内移植瘤小鼠的研究方法

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

a-simple-guide-screw-method-for-intracranial-xenograft-studies-in-mice

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22.9K 次观看.  Monash Institute of Medical Research. 为了评估新的治疗脑胶质瘤的治疗范式，生理相关的模型是必不可少的。颅内移植瘤模型的建立，是比立体定向的方法更快速，更安全，我们利用一个植入式丝杠程序。