Les auteurs tiennent à remercier Verlene Henry et Lindsay Holmes pour l&#39;aide au développement de ce modèle. Ce travail a été partiellement financé par la Fondation James S. McDonnell (# 220020173).

1. Les lignées cellulaires <ol><li> U87MG cellules de gliome sont cultivées dans de grands flacons de culture tissulaire avec du DMEM-F12 supplémenté avec 5% de sérum de veau fœtal (FBS). </li><li> Les cellules sont récoltées par les flacons de lavage à deux reprises avec du phosphate chaude saline tamponnée (PBS) et les incuber à 37 ° C pendant 5 minutes avec 10 ml de PBS contenant 0,25% de trypsine et 0,05% d&#39;EDTA. Une fois que les cellules sont levées, elles sont placées dans un tube de 50 ml contenant 10 ml de milieux de culture et centrifugés (300 X g pendant 4 min). </li><li> Après le lavage, les cellules sont resuspendues à une concentration de 10 x 10 6 / ml dans les milieux de culture, ce qui a permis pour un ensemencement de 50.000 cellules / 5 pl. </li><li> Les cellules sont conservées dans la glace jusqu&#39;à l&#39;injection intracrânienne. </li></ol> 2. Guide à vis intracrânienne boulonnage Cette procédure peut être effectuée plusieurs jours avant l&#39;injection des cellules. Toutes les procédures décrites ici ont été réalisées dans le cadre stricte des conditions stériles. <ol><li> Souris (BALB / c nu / nu féminin; 5-6 semaines, environ 18g) sont numérotées à des fins d&#39;identification, pesés et anesthésiés avec un intrapéritonéale (IP) par injection d&#39;un mélange de kétamine (100 mg / kg) et de xylazine (5 mg / kg). </li><li> La peau est essuyé avec une solution d&#39;iode et d&#39;une petite incision (2-3 mm) se fait le long du côté droit de la ligne médiane et antérieure à la ligne interaural. Cette situation expose les points de suture coronale et sagittale du crâne. Le bregma est positionné à la jonction de ces deux points de suture. </li><li> Le point d&#39;entrée Guide vis est ensuite marqué à un point de 2,5 mm latéral et 1 mm antérieure au bregma. Ce point est situé directement au-dessus du noyau caudé 1. </li><li> Un trou de 1 x 1 mm de profondeur est percé avec une main stériles maintenues foret à travers le crâne de la mère. </li><li> Une vis de guidage stérilisés qui s&#39;étendra de 1,6 mm sous la surface des crânes dans la dure-mère est ensuite boulonné dans le trou avec un tournevis jusqu&#39;à ce ras du crâne (figure 1A). </li><li> Un stylet stérile ou factices vis est ensuite placé dans le trou central de la vis de guide pour fermer l&#39;ouverture (figure 1B). </li><li> La plaie est fermée avec une colle tissulaire Vetbond (n-butyl cyanoacrylate) et les souris reçoivent une injection intrapéritonéale de reversine (petits animaux) (0,1 ml / kg) et carprofène (5 mg/kg/100 ul) pour l&#39;analgésie. Les souris sont ensuite autorisés à récupérer sur un tapis de réchauffement (36 ° C) qui peut prendre jusqu&#39;à 20 minutes. Les souris sont fréquemment suivis et observés pendant ce temps de récupération jusqu&#39;à ce qu&#39;ils soient pleinement conscients. </li></ol> 3. Intracrânienne greffe cellulaire <ol><li> Une seringue stérile menottées Hamilton est préparé en appliquant un petit anneau en plastique à la pointe de l&#39;aiguille permettant seulement 2 mm de l&#39;aiguille de prolonger en dessous de la sortie de la vis de guidage (figure 1B). Le point d&#39;inoculation final est donc de 3,5 mm en dessous de la surface du crâne. </li><li> Quatre jours après la chirurgie vis de guidage, les souris sont à nouveau anesthésiés comme ci-dessus (2,1) et une petite incision est faite sur la vis de guidage pour retirer le stylet. </li><li> La seringue menottées Hamilton est ensuite rempli avec 5 pi de bien prendre cellules mixtes précautions pour ne pas créer ou établir les bulles d&#39;air. </li><li> La seringue est fixé à la pompe de perfusion et de l&#39;aiguille est insérée dans la vis de guidage (figure 1C). Les cellules sont ensuite infusé à un taux de 30 ul par heure. </li><li> L&#39;appareil automatisé (figure 1D) nous a permis d&#39;injecter jusqu&#39;à 10 animaux en même temps à un débit constant. Les cellules peuvent également être injectés manuellement en utilisant la seringue Hamilton menottées ou bien la seringue peut être menotté par une pointe de pipette 200 ul qui a été coupé par 3 mm pour permettre à la pointe de l&#39;aiguille au-delà de la vis de guidage par 2 mm. L&#39;injection doit alors être effectuée à un rythme constant stable. </li><li> Lorsque la perfusion est terminée, la seringue est soigneusement enlevé et le stylet est remplacé dans la vis guide. La plaie est fermée collés et les souris sont donnés des médicaments de récupération comme avant (2,7) et a permis de récupérer sur un tapis de réchauffement. </li></ol> 4. Défi thérapeutique <ol><li> Quatre jours après l&#39;inoculation des cellules U87MG, les souris sont pesés et divisés au hasard en groupes de contrôle et de traitement. </li><li> Le groupe de contrôle est donné une intra-péritonéale (IP) d&#39;injection de PBS (100 pl), tandis que le groupe de traitement est donné une injection IP de AMG102 (100 ug dans 100 ul de PBS). </li><li> Les injections sont répétées tous les deux jours pendant 14 jours, un total de 6 injections (figure 2). </li><li> Après la dernière injection, les souris sont contrôlés quotidiennement et pesé tous les deux jours. </li><li> Lorsque les souris ont commencé à afficher significative des dysfonctionnements neurologiques (troubles de l&#39;équilibre, paralysie), la déshydratation, ou perte de poids de plus de 10% ou moribonds, ils étaient humainement euthanasiés. Ces humaine point final jours ont ensuite été enregistrées sur la courbe de survie de Kaplan-Meier. </li></ol> 5. Evaluation de l&#39;efficacité thérapeutique </p&gt; <ol><li> La courbe de survie de Kaplan-Meier a été généré en utilisant GraphPad Prism 4.03 pour Windows; GraphPad Software, San Diego, en Californie Etats-Unis, <a href="http://www.graphpad.com">www.graphpad.com</a> 3. Décès ou euthanizations étaient marqués comme point final des événements et un score de 1. Les animaux qui ont survécu à la fin de l&#39;expérience ont été enregistrées comme non-événements et notée 0. </li></ol> 6. Les résultats représentatifs: Les animaux témoins ont commencé à montrer des signes de troubles neurologiques et la perte de poids 23 jours après l&#39;inoculation initiale des cellules. Cela a été considérablement retardé dans le groupe traité AMG102 à 35 jours. En effet en 35 jours, 77% (n = 7 / 9) du groupe de contrôle avaient été euthanasiés. La courbe de survie de Kaplan-Meier démontre clairement l&#39;augmentation significative de la survie en réponse à AMG102 traitement (figure 3). En 70 jours, 88% des souris témoins ont été euthanasiés (n = 8 / 9), comparativement à 37% (n = 3 / 8) des AMG102 groupe traité. L&#39;analyse histologique des cerveaux a confirmé que tous les 9 animaux du groupe contrôle ont développé des tumeurs, comparativement à seulement 3 des 8 AMG102 souris traitées (figure 4). <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig1.jpg" /> Figure 1: Image (A) montre vis de guidage intracrânienne positionné dans une zone située directement au-dessus du noyau caudé. Le revers seringue Hamilton (pré-chargé avec des cellules) est alors placé à l&#39;intérieur de la vis guider afin que l&#39;aiguille de 2 mm d&#39;s&#39;étend au-delà du guide et les cellules sont injectées de 3,5 mm à l&#39;intérieur du noyau caudé. La seringue est ensuite retiré et remplacé par un stylet (B). Le dispositif de perfusion automatique (C) peut injecter jusqu&#39;à 10 animaux à la fois. On voit ici cinq injections simultanées (D). <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig2.jpg" /> Figure 2: Schéma du protocole de l&#39;étude. Les cellules ont été injectées au jour 0 avec un traitement à compter du jour 4. Les animaux témoins ont reçu une injection de PBS (100 pl) IP alors que le groupe de traitement ont reçu une injection de AMG102 (100 ug/100 ul) IP. Ces injections ont été réalisées tous les deux jours pendant 10 jours. Un total de 6 injections ont été administrées. Les animaux ont ensuite suivis pendant 70 jours des signes de troubles neurologiques et physiques. <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig3.jpg" /> Figure 3: courbe de survie de Kaplan-Meier comparant le contrôle et AMG102 souris traitées. Significative de la survie a été obtenue après un traitement par AMG102 (p = 0,005). <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig4.jpg" /> Figure 4: microphotographies de coupes de cerveau coronale montrant le développement de tumeurs chez les animaux témoins (A) et pas de développement de tumeurs cérébrales dans le AMG102 animaux traités (B). La barre d&#39;échelle est de 1 mm.

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	<li>Lal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+implantable+guide-screw+system+for+brain+tumor+studies+in+small+animals.">An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals.</a> J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).</li><li>Jun, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMG+102,+a+fully+human+anti-hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+neutralizing+antibody,+enhances+the+efficacy+of+temozolomide+or+docetaxel+in+U-87+MG+cells+and+xenografts.">AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts.</a> Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).</li><li>Pillay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+oncogene+addiction:+implications+for+targeted+therapies+directed+to+receptor+tyrosine+kinases.">The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases.</a> Neoplasia. 11, 448-458 (2009).</li><li>Buchanan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitization+of+glioma+cells+by+modulation+of+Met+signaling+with+the+hepatocyte+growth+factor+neutralizing+antibody.+AMG102.">Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102.</a> J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).</li><li>Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+II+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+AMG+102+(rilotumumab)+in+patients+with+recurrent+glioblastoma.">A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).</li><li>Caretti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Tumor+Growth+and+Post-Irradiation+Recurrence+in+a+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma+Mouse+Model.">Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model.</a> Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).</li><li>Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+brainstem+tumor+model:+functional+and+histopathological+characterization.">A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization.</a> Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).</li><li>Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+epidermal+growth+factor+receptor-specific+antibodies+against+gliomaxenografts+is+influenced+by+receptor+levels,+activation+status,+and+heterodimerization.">The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization.</a> Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).</li><li>Scott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+clinical+trial+with+monoclonal+antibody+ch806+targeting+transitional+state+and+mutant+epidermal+growth+factor+receptors.">A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).</li><li>Niyazi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+options+for+recurrent+malignant+glioma.">Therapeutic options for recurrent malignant glioma.</a> Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).</li></ol>

Ce travail a été soutenu par une subvention de recherche d&#39;Amgen Inc

La méthode Guide intracrânienne vis présentée ici permet la création rapide et reproductible des xénogreffes intracrânienne et dans les mains d&#39;un technicien animalier qualifié, cette procédure est très facile à réaliser sans la nécessité d&#39;un dispositif de stéréotaxie. Notre méthode combine l&#39;utilisation d&#39;une vis de guide, de localiser avec précision la région du cerveau la plus appropriée pour le développement tumoral in vivo, et une pompe à perfusion automatisée qui permet de l&#39;inoculation simultanée d&#39;un maximum de 10 animaux à la fois. La procédure d&#39;augmentation guide-vis prend moins de 5 minutes à effectuer. La perfusion automatisée des cellules à 30 pl / heure prend seulement 10 minutes pour un volume de 5 pl. Ceci assure un dosage précis à un taux constant et réduit le risque d&#39;expulsion de cellules dans la zone extra-crânienne due à la pression intracrânienne accrue. Nous avons également effectué cette procédure avec 10 volumes ul et n&#39;ont observé aucun croissance tumorale extra-crâniennes dues au reflux cellulaire. Comme la pompe à perfusion automatisée permet aussi plusieurs animaux à inoculer simultanément, nous pouvons injecter jusqu&#39;à 60 animaux par heure, comparativement à une procédure stéréotaxique qui est limitée à environ 15 animaux par heure. L&#39;étape la plus critique dans cette procédure est l&#39;emplacement des vis de guidage dans le crâne que sa position détermine l&#39;emplacement final du volume de la tumeur. Si la vis guide est trop centrale, les cellules vont être injectés dans une région entre les deux hémisphères du cerveau alors que si le guide est placé au loin vers l&#39;avant, les cellules ne sera pas injecté dans le cerveau du tout. Il est donc essentiel d&#39;être aussi précis que possible de localiser le guide latéral et 2,5 mm à 1 mm en avant de la bregma 1. Dans cette étude nous avons utilisé une vis de guidage en acier, bien que les vis de guidage en plastique sont également disponibles pour ceux qui nécessitent des études d&#39;imagerie cérébrale comme l&#39;IRM ou PET 6. Même si la pompe à perfusion automatisée est un coût prohibitif pour certains groupes, les cellules peuvent encore être injectés manuellement plus rapidement que les approches de stéréotaxie. Globalement, cette méthode rapide, précise et reproductible peut être utilisée pour étudier le gliome, médulloblastome et les tumeurs du tronc cérébral 7. Cette procédure a été effectuée sur plus de 500 souris entre nos deux laboratoires avec les décès dus à des réactions inattendues anesthésie (&lt;1%). Les souris qui ont été boulonnés avec la vis de guide et ensuite infusé avec des cellules n&#39;ont pas mourir ou de souffrir de complications neurologiques à la suite de la procédure. Les animaux ont survécu passé 100 jours sans aucune complication. Bien que nous avons préféré utiliser une souris sans poils, une souris immuno-compromis avec les cheveux comme le SCID serait tout aussi approprié fourni les cheveux du crâne a été retiré avant la chirurgie pour garder le site propre et pour empêcher les cheveux interférer avec vis de guidage. Il ya plusieurs nouveaux traitements actuellement développé pour le traitement du gliome 8-10. Récemment, nous avons montré que sous-cutanée U87MG xénogreffes de gliome peut être inhibée par un traitement avec AMG102 3; un anticorps humanisé dirigé vers HGF actuellement en cours d&#39;évaluation clinique dans les gliomes 5. Nous avons utilisé la méthode de décrire ici d&#39;établir des tumeurs intracrâniennes U87MG dans le cerveau des souris nude. Notre étude montre clairement l&#39;utilité de la méthode et démontre que AMG102 inhibe significativement la croissance de xénogreffes de U87MG orthotopique. Nous allons continuer à utiliser ce modèle pour déterminer quelles autres thérapeutiques peuvent être utilisées en combinaison avec AMG102 d&#39;obtenir une inhibition plus efficace de la croissance tumorale.

<table border="1"><tbody><tr><th> Nom du réactif </th><th> Société </th><th> Numéro de catalogue </th><th> Commentaires (optionnel) </th></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12634010 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> Bovogen </td><td> SFB </td><td></td></tr><tr><td> Trypsine </td><td> Invitrogen </td><td> 15050065 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> Sigma </td><td> E6758 </td><td></td></tr><tr><td> Balb / c souris nu / nu </td><td> ARC Perth </td><td></td><td></td></tr><tr><td> Titulaire à vis </td><td> Un Plastiques </td><td> SD-1 </td><td></td></tr><tr><td> Porte-foret </td><td> Un Plastiques </td><td> DH-1 </td><td></td></tr><tr><td> Forets </td><td> Un Plastiques </td><td> D # 60 </td><td></td></tr><tr><td> Vis guide (en métal) </td><td> Un Plastiques </td><td> C212SG </td><td></td></tr><tr><td> Dummy Vis (stylet) </td><td> Un Plastiques </td><td> C212SD </td><td></td></tr><tr><td> Seringue Hamilton (10 pi aiguille 26g cimenté) </td><td> Division Grace Discovery Science </td><td> 80075 </td><td></td></tr><tr><td> Pompe à perfusion PHD 22/2000 </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 70-2003 </td><td> En option </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> Thermo pad </td><td> Harvard Apparatus </td><td> 340390 </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice

Le greffage de cellules tumorales humaines dans le cerveau des souris immunodéprimées est une méthode établie pour l&#39;étude des cancers du cerveau, notamment le glioblastome (gliome) et médulloblastome. L&#39;approche stéréotaxique largement utilisée ne permet pour l&#39;injection d&#39;un seul animal à la fois, beaucoup de travail et nécessite un équipement hautement spécialisé. La méthode vis de guide, initialement développé par Lal et al., 1 a été développé pour éliminer les procédures stéréotaxiques encombrant. Nous allons maintenant décrire une approche Guide modifiés vis qui est rapide et exceptionnellement sûr; qui sont tous deux essentiels des considérations éthiques. Notamment, notre procédure intègre désormais une pompe à perfusion qui permet jusqu&#39;à 10 animaux destinés à être injectés simultanément avec des cellules tumorales. Pour démontrer l&#39;utilité de cette procédure, nous avons établi des cellules de gliome humain U87MG que les xénogreffes intracrânienne chez la souris, qui ont ensuite été traitées avec AMG102; un anticorps entièrement humain dirigé vers HGF / facteur de dispersion actuellement l&#39;objet d&#39;une évaluation clinique 2-5. Injection systémique de AMG102 significativement prolongé la survie de toutes les souris avec des xénogreffes U87MG intracrânienne et a abouti à un certain nombre de guérisons complètes. Cette étude démontre que la méthode vis de guide est un peu coûteux, l&#39;approche hautement reproductible pour l&#39;établissement de xénogreffes intracrânienne. Par ailleurs, il fournit un modèle pertinent physiologiques pour valider de nouvelles stratégies thérapeutiques pour le traitement des cancers du cerveau.

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A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Afin d&#39;évaluer de nouveaux paradigmes thérapeutiques pour le traitement du gliome, physiologiques des modèles pertinents sont essentiels. Nous utilisons une procédure de guider implantable à vis pour l&#39;établissement des modèles de xénogreffe intracrânienne qui est plus rapide et plus sûr que les approches stéréotaxique.

Une méthode simple guide de vis pour intracrânienne études de xénogreffe chez la souris

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

23.0K vues.  Monash Institute of Medical Research. Afin d'évaluer de nouveaux paradigmes thérapeutiques pour le traitement du gliome, physiologiques des modèles pertinents sont essentiels. Nous utilisons une procédure de guider implantable à vis pour l'établissement des modèles de xénogreffe intracrânienne qui est plus rapide et plus sûr que les approches stéréotaxique.

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Guide Wire Assisted Catheterization and Colored Dye Injection for Vascular Mapping of Monochorionic Twin Placentas

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC twin pregnancies develop complications arising from the shared placenta and associated vascular connections1. Severe twin-to-twin syndrome (TTTS) is reported to account for approximately 20% of these complications2,3. Inter-twin vascular connections occur in almost all MC placentas and are related to the prognosis and outcome of these high-risk twin pregnancies. The number, size and type of connections have been implicated in the development of TTTS and other MC twin conditions. Three types of inter-twin vascular connections occur: 1) artery to vein connections (AVs) in which a branch artery carrying deoxygenated blood from one twin courses along the fetal surface of the placenta and dives into a placental cotyledon. Blood flows via a deep intraparenchymal capillary network into a draining vein that emerges at the fetal surface of the placenta and brings oxygenated blood toward the other twin. There is unidirectional flow from the twin supplying the afferent artery toward the twin receiving the efferent vein; 2) artery to artery connections (AAs) in which a branch artery from each twin meets directly on the superficial placental surface resulting in a vessel with pulsatile bidirectional flow, and 3) vein to vein connections (VVs) in which a branch vein from each twin meets directly on the superficial placental surface allowing low pressure bidirectional flow. In utero obstetric sonography with targeted Doppler interrogation has been used to identify the presence of AV and AA connections4. Prenatally detected AAs that have been confirmed by postnatal placental injection studies have been shown to be associated with an improved prognosis for both twins5. Furthermore, fetoscopic laser ablation of inter-twin vascular connections on the fetal surface of the shared placenta is now the preferred treatment for early, severe TTTS. 
Postnatal placental injection studies provide a valuable method to confirm the accuracy of prenatal Doppler ultrasound findings and the efficacy of fetal laser therapy6. Using colored dyes separately hand-injected into the arterial and venous circulations of each twin, the technique highlights and delineates AVs, AAs, and VVs. This definitive demonstration of MC placental vascular anatomy may then be correlated with Doppler ultrasound findings and neonatal outcome to enhance our understanding of the pathophysiology of MC twinning and its sequelae. Here we demonstrate our placental injection technique.

Vascular mapping of monochorionic (MC) twin placentas after birth provides a means for detailed demonstration of vascular connections between the twins&#x2019; circulations. 
Imbalance of these connections is thought to play a pivotal role in the development of complications of MC twinning including twin-to-twin transfusion syndrome.

Cathétérisme Guide fil assistée et coloré pour la cartographie d&#39;injection de colorant vasculaires de monochoriales placentas jumelles

Monochorionic (MC) twin pregnancies are associated with significantly higher morbidity and mortality rates than dichorionic twins. Approximately 50% of MC ...

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Médecine

Epidural Intracranial Pressure Measurement in Rats Using a Fiber-optic Pressure Transducer

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and cardiac arrest. This elevation may result in further neurological injury, in the form of transtentorial herniation1,2,3,4, midbrain compression, neurological deficit or increased cerebral infarct2,4. Current therapies are often inadequate to control elevated ICP in the clinical setting5,6,7 . Thus there is a need for accurate methods of ICP measurement in animal models to further our understanding of the basic mechanisms and to develop new treatments for elevated ICP.
In both the clinical and experimental setting ICP cannot be estimated without direct measurement. Several methods of ICP catheter insertion currently exist. Of these the intraventricular catheter has become the clinical 'gold standard' of ICP measurement in humans8. This method involves the partial removal of skull and the instrumentation of the catheter through brain tissue. Consequently, intraventricular catheters have an infection rate of 6-11%9. For this reason, subdural and epidural cannulations have become the preferred methods in animal models of ischemic injury. 
Various ICP measurement techniques have been adapted for animal models, and of these, fluid-filled telemetry catheters10 and solid state catheters are the most frequently used11,12,13,14,15. The fluid-filled systems are prone to developing air bubbles in the line, resulting in false ICP readings. Solid state probes avoid this problem (Figure 1). An additional problem is fitting catheters under the skull or into the ventricles without causing any brain injury that might alter the experimental outcomes. Therefore, we have developed a method that places an ICP catheter contiguous with the epidural space, but avoids the need to insert it between skull and brain. 
An optic fibre pressure catheter (420LP, SAMBA Sensors, Sweden) was used to measure ICP at the epidural location because the location of the pressure sensor (at the very tip of the catheter) was found to produce a high fidelity ICP signal in this model. There are other manufacturers of similar optic fibre technologies13 that may be used with our methodology. Alternative solid state catheters, which have the pressure sensor located at the side of the catheter tip, would not be appropriate for this model as the signal would be dampened by the presence of the monitoring screw. 
Here, we present a relatively simple and accurate method to measure ICP. This method can be used across a wide range of ICP related animal models.

A novel technique to record the pressures within the skull is described. The minimally invasive method uses a fibre-optic pressure sensing system to accurately measure intracranial pressure (ICP) in anaesthetized rats without causing significant brain trauma. The technique may be used in a wide range of experimental models.

Péridurale Mesure de la pression intracrânienne chez le rat en utilisant un transducteur de pression à fibre optique

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

Une méthode simple d&#39;intubation poumon de souris

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a novel platform that allows for direct long-term visualization of tissue structure changes intracranially. Imaging at a single cell resolution in a real-time fashion provides supplementary dynamic information beyond that provided by standard end-point histological analysis, which looks solely at 'snap-shot' cross sections of tissue.
Establishing this intravital imaging technique in fluorescent chimeric mice, we are able to image four fluorescent channels simultaneously. By incorporating fluorescently labeled cells, such as GFP+ bone marrow, it is possible to track the fate of these cells studying their long-term migration, integration and differentiation within tissue. Further integration of a secondary reporter cell, such as an mCherry glioma tumor line, allows for characterization of cell:cell interactions. Structural changes in the tissue microenvironment can be highlighted through the addition of intra-vital dyes and antibodies, for example CD31 tagged antibodies and Dextran molecules.
Moreover, we describe the combination of our ICW imaging model with a small animal micro-irradiator that provides stereotactic irradiation, creating a platform through which the dynamic tissue changes that occur following the administration of ionizing irradiation can be assessed.
Current limitations of our model include penetrance of the microscope, which is limited to a depth of up to 900 &mu;m from the sub cortical surface, limiting imaging to the dorsal axis of the brain. The presence of the skull bone makes the ICW a more challenging technical procedure, compared to the more established and utilized chamber models currently used to study mammary tissue and fat pads 5-7. In addition, the ICW provides many challenges when optimizing the imaging.

A Novel High-resolution In vivo Imaging Technique to Study the Dynamic Response of Intracranial Structures to Tumor Growth and Therapeutics

We describe a novel in vivo imaging technique that couples fluorescent chimeric mice with intracranial windows and high-resolution 2-photon microscopy. This imaging platform aids studies of dynamic changes in brain tissue and microvasculature, at a single-cell level, following pathological insults and is adaptable to assess intracranial drug delivery and distribution.

A Novel haute résolution<em&gt; In vivo</em&gt; Technique d&#39;imagerie pour étudier la réponse dynamique des structures intracrâniennes à la croissance tumorale et de thérapeutique

We have successfully integrated previously established Intracranial window (ICW) technology 1-4 with intravital 2-photon confocal microscopy to develop a ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

Le<em&gt; En ovo</em&gt; CAM-test comme un Xenograftmodel pour le sarcome

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

Infusions de l&#39;artère carotide pour pharmacocinétiques et pharmacodynamiques Analyse des taxanes chez la souris

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

Une simple critique de taille fémorale défauts modèle chez la souris

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals

Prior to testing novel therapeutics in humans, short and long term preclinical (i.e., animal), repetitive pharmacological and toxicological testing is required. In most cases, the preferred route of administration is via oral delivery. At the present time, oral delivery is mostly accomplished using an oral gavage procedure, in part, because it can achieve consistent and precise dosing in the animal model. Although this method is well established it does have complications that can result in a high rate of animal attrition. To this end, the procedure introduced here describes an alternative to the oral gavage method in which the desired drug is incorporated into a tastant, orally dissolving strip (ODS) that can simply be presented to the test animal where it is then rapidly taken up with minimal manipulation of the test subject. Herein, we demonstrate that preclinical, oral drug delivery using the ODS method represents a safe, convenient, and humane alternative to oral gavage.

The following protocol describes a novel method for chronic oral drug administration using an orally dissolving strip (ODS) in lieu of the more commonly used oral gavage method. We demonstrate that preclinical, oral drug delivery using the ODS method represents a safe, convenient, and humane alternative to oral gavage.

Utilisant une bande Dissoudre Oralement pour les études pharmacologiques et toxicologiques: une alternative simple et Humane à Oral Gavage pour les animaux

Prior to testing novel therapeutics in humans, short and long term preclinical (i.e., animal), repetitive pharmacological and toxicological testing is ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

Une méthode améliorée pour Rapid intubation de la trachée chez la souris

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

Une méthode de quantification des performances du membre supérieur dans la vie quotidienne utilisant des accéléromètres

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...