המחברים מבקשים להודות Verlene הנרי הולמס לינדזי לסיוע בפיתוח המודל הזה. עבודה זו מומנה בחלקה על ידי ג&#39;יימס ס &#39;מקדונל קרן (# 220020173).

1. שורות תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> U87MG glioma הם תאים בתרבית רקמה גדול תרבות צלוחיות עם DMEM-F12 בתוספת 5% נסיוב עוברי שור (FBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים נקצרים על ידי שטיפה צלוחיות פעמיים עם בופר פוספט חם (PBS) וכן דוגרים אותם 37 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות עם 10 מ&quot;ל של PBS המכילה טריפסין 0.25% ו 0.05% EDTA. לאחר התאים הרים, הם ממוקמים לתוך צינור 50 מ&quot;ל המכיל 10 מ&quot;ל של התקשורת בתרבות centrifuged (300 גרם X דקות 4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות לשטוף, תאים resuspended בריכוז של 10 x 10 6 / ml בתקשורת תרבות, שאיפשר הרכבה של 50,000 תאים / 5 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תאים הם שמרו על הקרח עד הזרקה תוך גולגולתי. </li></ol> 2. מדריך בורג נעילה תוך גולגולתי הליך זה יכול להתבצע מספר ימים לפני הזרקה של תאים. הנהלים כל המתואר כאן בוצעו בתנאים סטריליים קפדניים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים (BALB / c נו / נו נקבה, 5-6 שבועות, כ 18g) ממוספרים למטרות זיהוי, שקלו anesthetised עם זריקה (IP) intraperitoneal מתערובת של קטמין (100 מ&quot;ג / ק&quot;ג) ו xylazine (5 מ&quot;ג / ק&quot;ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העור הוא ניגב את פתרון יוד חתך קטן (2-3 מ&quot;מ) נעשית בצד הימני של קו האמצע ו קדמית לקו interaural. זה חושף את התפרים העטרה ועל sagittal הגולגולת. גבחת ממוקמת בצומת של שני התפרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורג המדריך נקודת כניסה ואז מסומן בנקודה 2.5 מ&quot;מ לרוחב ו - 1 מ&quot;מ הקדמי כדי גבחת. נקודה זו ממוקמת ישירות מעל גרעין caudate 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 1 x 1 מ&quot;מ חור עמוק הוא קדח ביד סטרילי נערך תרגיל טוויסט דרך הגולגולת אל דורא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בורג מדריך מעוקרים כי ירחיבו 1.6 מ&quot;מ מתחת לפני השטח גולגולות לתוך הדורה הוא מוברג אז עם נהג בורג לתוך החור עד מיושר עם הגולגולת (איור 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Stylet סטרילי או דמה הבורג ממוקם מכן לתוך חור הבורג המרכזי של המדריך כדי לסגור את הפתח (איור 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפצע נסגר עם דבק רקמות Vetbond (n-בוטיל cyanoacrylate) ואת העכברים מקבלים זריקה intraperitoneal של reversine (חיות קטנות) (0.1 מ&quot;ל / ק&quot;ג) ו carprofen (5 mg/kg/100 μl) על כאבים. עכברים מותר אז כדי להתאושש על מחצלת התחממות (36 ° C), אשר עשוי להימשך עד 20 דקות. עכברים מנוטרים בתדירות גבוהה נצפתה בתקופה זו התאוששות עד שהם בהכרה מלאה. </li></ol> 3. Engraftment הסלולר תוך גולגולתי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק סטרילי אזוקות המילטון מוכן ידי החלת טבעת פלסטיק קטנה עד קצה המחט ומאפשר רק 2 מ&quot;מ של המחט להאריך מתחת לשקע את הבורג מדריך (איור 1B). נקודת הרכבה הסופי ולכן הוא 3.5 מ&quot;מ מתחת לפני השטח את הגולגולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבעה ימים לאחר הניתוח את הבורג מדריך, עכברים הם שוב הרדים לעיל (2.1) ו חתך קטן הוא עשה מעל הבורג מדריך להסרת stylet. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק אזוקות המילטון הוא מלא אז עם 5 μl של תאים מעורבים גם לקחת אמצעי זהירות כדי לא ליצור או לערוך כל בועות האוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מזרק הוא מאובטח המשאבה זלוף ואת המחט מוחדרת לתוך בורג את המדריך (תרשים 1C). התאים הם חדורים אז בשיעור של 30 μl לשעה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המנגנון האוטומטי (איור 1D) אפשרה לנו להזריק עד 10 חיות בכל פעם בקצב זרימה מתמדת. תאים יכולים גם להיות מוזרק באופן ידני באמצעות מזרק אזוקות המילטון או לחילופין המזרק ניתן אזיקים על ידי טיפ 200 פיפטה μl כי כבר גזוז של 3 מ&quot;מ על מנת לאפשר את קצה מחט להרחיב מעבר לדפוק את המדריך של 2 מ&quot;מ. הזריקה חייבת אז להתבצע בקצב קבוע קבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עירוי תושלם, המזרק הוא הוציא בזהירות את stylet מוחלף לתוך בורג את המדריך. הפצע מודבק סגור העכברים ניתנות תרופות התאוששות כמו קודם (2.7) ואיפשר להתאושש על מחצלת ההתחממות. </li></ol> 4. טיפולית אתגר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארבעה ימים לאחר חיסון התא U87MG, עכברים הם שקלו וחילקו באקראי לתוך מלאה קבוצות הטיפול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בקבוצת הביקורת ניתן התוך צפקי (IP) הזרקה של PBS (100 μl), ואילו בקבוצת הטיפול ניתנת זריקה IP של AMG102 (100 מיקרוגרם ב 100 μl של PBS). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זריקות חוזרות מדי יום שני במשך 14 ימים, סך של 6 זריקות (איור 2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הזריקה האחרונה, עכברים מנוטרים יומי שקל כל יום שני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר העכברים החלו להציג משמעותי בתפקוד הנוירולוגי (הפרעה באיזון, שיתוק), התייבשות, או ירידה במשקל של יותר מ 10% או גוסס, הם היו euthanised אנושי. אנושי אלה נקודת הסיום ימים נרשמו אז על עקומת Kaplan-Meier ההישרדות. </li></ol> 5. הערכת יעילות טיפולית </p&gt; <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עקומת Kaplan-Meier הישרדות נוצר באמצעות GraphPad פריזמה 4.03 עבור Windows, תוכנה GraphPad, סן דייגו קליפורניה, ארה&quot;ב, <a href="http://www.graphpad.com">www.graphpad.com</a> 3. פטירות או euthanizations סומנו כמטרה נקודות אירועים הבקיע כמו 1. בעלי חיים שנותרו בחיים בתום הניסוי נרשמו אירועים שאינם ציונים כמו 0. </li></ol> 6. נציג התוצאות: חיות בקרת החלה להראות סימנים של הפרעה נוירולוגית וירידה במשקל 23 ימים לאחר חיסון ראשוני של תאים. זו התעכבה באופן משמעותי בקבוצה שטופלה AMG102 עד 35 ימים. ואכן ביום 35, 77% (n = 09/07) של קבוצת הביקורת היו מורדמים. עקומת Kaplan-Meier הישרדות מדגים בבירור את הגידול המשמעותי הישרדות התגובה לטיפול AMG102 (איור 3). ביום 70, 88% של עכברים שליטה היו מורדמים (n = 09/08) לעומת 37% (n = 3 / 8) של קבוצת AMG102 טיפול. ניתוח היסטולוגית של המוח אישר כי כל בעלי חיים 9 בקבוצת הביקורת פיתחו גידולים לעומת 3 בלבד של 8 AMG102 העכברים שטופלו (איור 4). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig1.jpg" /> איור 1: תמונה (A) מראה בורג מדריך תוך גולגולתי ממוקם באזור ממוקם ישירות מעל גרעין caudate. אזוקות המילטון מזרק (טעון מראש עם תאים) ממוקמת ואז בתוך בורג מדריך כך 2 מ&quot;מ של מחט חורג מדריך לבין התאים מוזרקים 3.5 מ&quot;מ בתוך גרעין caudate. המזרק הוסר מאוחר יותר הוחלף על ידי stylet (B). מכשיר העירוי האוטומטי (ג) ניתן להזריק עד 10 בעלי חיים בכל פעם. המוצג כאן חמש זריקות סימולטני (ד &#39;). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig2.jpg" /> איור 2: סכמטי של פרוטוקול המחקר. הוזרקו תאים ביום 0 עם הטיפול החל ביום 4. חיות בקרת קיבלה זריקה של PBS (100 μl) IP ואילו קבוצת הטיפול קיבלה זריקה של AMG102 (100 μg/100 μl) IP. זריקות אלו ניתנו כל היום השני במשך 10 ימים. סך של 6 זריקות ניתנו. בעלי חיים היו במעקב במשך 70 ימים ואז סימנים של הפרעות נוירולוגיות פיזית. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig3.jpg" /> איור 3: Kaplan-Meier עקומת ההישרדות השוואה מלאה AMG102 העכברים שטופלו. הישרדות משמעותי הושג לאחר טיפול עם AMG102 (p = 0.005). <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/3157/3157fig4.jpg" /> איור 4: Microphotographs סעיפים המוח העטרה הוכחת התפתחות הגידול של חיות מלאה (א) ולא התפתחות המוח הגידול של בעלי חיים שטופלו AMG102 (B). בר סולם הוא 1 מ&quot;מ.

<ol>
	<li>Lal, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+implantable+guide-screw+system+for+brain+tumor+studies+in+small+animals.">An implantable guide-screw system for brain tumor studies in small animals.</a> J Neurosurg. 92, 326-333 (2000).</li><li>Jun, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AMG+102,+a+fully+human+anti-hepatocyte+growth+factor/scatter+factor+neutralizing+antibody,+enhances+the+efficacy+of+temozolomide+or+docetaxel+in+U-87+MG+cells+and+xenografts.">AMG 102, a fully human anti-hepatocyte growth factor/scatter factor neutralizing antibody, enhances the efficacy of temozolomide or docetaxel in U-87 MG cells and xenografts.</a> Clin Cancer Res. 13, 6735-6742 (2007).</li><li>Pillay, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+plasticity+of+oncogene+addiction:+implications+for+targeted+therapies+directed+to+receptor+tyrosine+kinases.">The plasticity of oncogene addiction: implications for targeted therapies directed to receptor tyrosine kinases.</a> Neoplasia. 11, 448-458 (2009).</li><li>Buchanan, I. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Radiosensitization+of+glioma+cells+by+modulation+of+Met+signaling+with+the+hepatocyte+growth+factor+neutralizing+antibody.+AMG102.">Radiosensitization of glioma cells by modulation of Met signaling with the hepatocyte growth factor neutralizing antibody. AMG102.</a> J Cell Mol Med. 15, 1999-2006 (2011).</li><li>Wen, P. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+II+study+evaluating+the+efficacy+and+safety+of+AMG+102+(rilotumumab)+in+patients+with+recurrent+glioblastoma.">A phase II study evaluating the efficacy and safety of AMG 102 (rilotumumab) in patients with recurrent glioblastoma.</a> Neuro Oncol. 13, 437-446 (2011).</li><li>Caretti, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Monitoring+of+Tumor+Growth+and+Post-Irradiation+Recurrence+in+a+Diffuse+Intrinsic+Pontine+Glioma+Mouse+Model.">Monitoring of Tumor Growth and Post-Irradiation Recurrence in a Diffuse Intrinsic Pontine Glioma Mouse Model.</a> Brain Pathol. 4, 441-451 (2011).</li><li>Jallo, G. I., Volkov, A., Wong, C., Carson, B. S., Penno, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+novel+brainstem+tumor+model:+functional+and+histopathological+characterization.">A novel brainstem tumor model: functional and histopathological characterization.</a> Childs Nerv. Syst. 22, 1519-1525 (2006).</li><li>Johns, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+efficacy+of+epidermal+growth+factor+receptor-specific+antibodies+against+gliomaxenografts+is+influenced+by+receptor+levels,+activation+status,+and+heterodimerization.">The efficacy of epidermal growth factor receptor-specific antibodies against gliomaxenografts is influenced by receptor levels, activation status, and heterodimerization.</a> Clin Cancer Res. 13, 1911-1925 (2007).</li><li>Scott, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+phase+I+clinical+trial+with+monoclonal+antibody+ch806+targeting+transitional+state+and+mutant+epidermal+growth+factor+receptors.">A phase I clinical trial with monoclonal antibody ch806 targeting transitional state and mutant epidermal growth factor receptors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 104, 4071-4076 (2007).</li><li>Niyazi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Therapeutic+options+for+recurrent+malignant+glioma.">Therapeutic options for recurrent malignant glioma.</a> Radiother. Oncol. 98, 1-14 (2011).</li></ol>

עבודה זו נתמכה על ידי מענק מחקר של חברת Amgen

המדריך תוך גולגולתי בורג השיטה המוצגת כאן מאפשרת הקמת לשחזור מהיר של xenografts תוך גולגולתי וכן בידי טכנאי מיומן בעל חיים, הליך זה מתבצע בקלות רבה ללא צורך בהתקן stereotactic. השיטה שלנו משלבת את השימוש של בורג מדריך, כדי לאתר במדויק את האזור של המוח המתאים ביותר בהתפתחות הגידול vivo, ואת משאבת עירוי אוטומטי המאפשר חיסון בו זמנית של עד 10 בעלי חיים בכל פעם. בורג מדריך הליך הגדלת לוקח פחות מ 5 דקות לבצע. עירוי של תאים אוטומטיות ב 30 μl / שעה לוקח רק 10 דקות עבור נפח של 5 μl. זה מבטיח מינון מדויק בקצב קבוע מפחיתה את הסיכון של גירוש תא לאזור נוסף גולגולתי עקב לחץ תוך גולגולתי מוגבר. יש לנו גם ביצע הליך זה עם 10 כרכים μl ולא נצפו כל צמיחה נוספת גולגולתי גידול עקב ריפלוקס הסלולר. כמו משאבת אינפוזיה אוטומטיות מאפשר גם מספר חיות לקבל חיסונים בו זמנית אנו יכולים להזריק עד 60 חיות לשעה לעומת הליך stereotactic אשר מוגבל כ 15 חיות לשעה. השלב הקריטי ביותר בהליך זה הוא המיקום של בורג מדריך בגולגולת כמו מעמדה קובעת את המיקום הסופי של עיקר הגידול. אם בורג מדריך מרכזי מדי, התאים יהיה מוזרק באזור בין שתי האונות במוח ואילו אם מדריך מושם על הרבה קדימה, התאים לא יהיה שהוזרקו למוח בכלל. לכן חיוני כדי להיות מדויקת ככל האפשר באיתור 2.5 מדריך מ&quot;מ לרוחב ו - 1 מ&quot;מ הקדמי של גבחת 1. במחקר זה השתמשנו בורג מדריך פלדה, למרות ברגים מדריך פלסטיק זמינים גם עבור אלו שדורשים מחקרים הדמיה מוחית כגון MRI או PET 6. אפילו אם משאבת אינפוזיה אוטומטיות היא עלות אוסרני עבור קבוצות מסוימות, התאים עדיין יכול להיות מוזרק ידנית במהירות רבה יותר מאשר גישות stereotactic. באופן כללי, שיטה זו מהירה, מדויקת לשעתקו יכול לשמש כדי ללמוד, glioma מדולובלסטומה ו גזע גידולים במוח 7. פרוצדורה זו שבוצעה על מעל 500 עכברים בין שתי מעבדות עם מקרי מוות עקב תגובות בלתי צפויות הרדמה (&lt;1%). עכברים שהיו מוברג עם בורג את המדריך חדורים לאחר מכן עם תאים לא למות או לסבול סיבוכים נוירולוגיים כתוצאה של ההליך. בעלי חיים שרדו בעבר 100 ימים ללא סיבוכים כלשהם. למרות שאנו מעדיפים להשתמש בעכבר שיער, עכבר חיסונית פגיעה בשיער כמו SCID יהיה בדיוק כמו המתאימה בתנאי שיער הגולגולת שהוסר לפני הניתוח כדי לשמור על האתר נקי כדי למנוע שיער להפריע בורג מדריך. ישנם כיום מספר הרפוי הרומן שמפתחת לטיפול glioma 8-10. לאחרונה הראינו כי תת עורית U87MG xenografts glioma יכול להיות מעוכבים על ידי טיפול AMG102 3; נוגדן אנושי להפנות HGF כעת בתהליך הערכה קלינית glioma 5. השתמשנו בשיטת לתאר כאן כדי להקים גידולים תוך גולגולתי U87MG במוחם של עכברים בעירום. המחקר שלנו מראה בבירור את התועלת של השיטה ומדגים כי AMG102 משמעותית מעכב את צמיחת xenografts U87MG orthotopic. אנו נמשיך להשתמש במודל זה כדי לקבוע מה ותרופות אחרות ניתן להשתמש בשילוב עם AMG102 להשיג עיכוב יעיל יותר של הגידול.

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> שם מגיב </th><th> חברה </th><th> מספר קטלוגי </th><th> הערות (אופציונלי) </th></tr><tr><td> DMEM/F12 </td><td> Invitrogen </td><td> 12634010 </td><td></td></tr><tr><td> FCS </td><td> Bovogen </td><td> SFBS </td><td></td></tr><tr><td> טריפסין </td><td> Invitrogen </td><td> 15050065 </td><td></td></tr><tr><td> EDTA </td><td> סיגמא </td><td> E6758 </td><td></td></tr><tr><td> Balb / c נו / נו עכברים </td><td> ARC פרת&#39; </td><td></td><td></td></tr><tr><td> בורג מחזיק </td><td> פלסטיקה אחת </td><td> SD-1 </td><td></td></tr><tr><td> מחזיק מקדחה </td><td> פלסטיקה אחת </td><td> DH-1 </td><td></td></tr><tr><td> Drill Bit </td><td> פלסטיקה אחת </td><td> D # 60 </td><td></td></tr><tr><td> בורג מדריך (מתכת) </td><td> פלסטיקה אחת </td><td> C212SG </td><td></td></tr><tr><td> בורג Dummy (חרט) </td><td> פלסטיקה אחת </td><td> C212SD </td><td></td></tr><tr><td> המילטון מזרק (10 μl מחט ביצרו 26g) </td><td> גרייס חטיבת Discovery Science </td><td> 80075 </td><td></td></tr><tr><td> PHD 22/2000 משאבת עירוי </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 70-2003 </td><td> אופציונלי </td></tr><tr><td> Vetbond </td><td> 3M </td><td> 1469SB </td><td></td></tr><tr><td> Thermo כרית </td><td> הרווארד Apparatus </td><td> 340390 </td><td></td></tr></tbody></table>

a simple guide screw method for intracranial xenograft studies in mice

השתלת תאים סרטניים של אדם לתוך המוח של עכברים immunosuppressed היא שיטה שהוקם לחקר סרטן המוח כולל גליובלסטומה (גליומה) ו מדולובלסטומה. הגישה stereotactic בשימוש נרחב רק מאפשר הזרקה של חיה אחת בכל פעם, הוא עבודה אינטנסיבית ודורשת ציוד מיוחד מאוד. בורג המדריך השיטה, שפותחה לראשונה על ידי לאל et al., 1 פותחה כדי למנוע הליכים stereotactic מסורבלת. כעת אנו מתארים בורג שונה מדריך גישה מהירה ובטוחה באופן יוצא דופן, הן אלו שיקולים אתיים קריטי. יש לציין, נוהל שלנו עכשיו משלבת משאבת עירוי המאפשר עד 10 חיות להיות מוזרק בד בבד עם תאים סרטניים. כדי להדגים את התועלת של הליך זה, הקמנו האדם תאים glioma U87MG כמו xenografts תוך גולגולתי בעכברים אשר טופלו אז עם AMG102; נוגדן אנושי מלא להפנות HGF / גורם פיזור כעת בתהליך 2-5 הערכה קלינית. הזרקת מערכתית של AMG102 ממושך משמעותית את ההישרדות של כל העכברים עם xenografts U87MG תוך גולגולתי וגרם למספר מרפא להשלים. מחקר זה מוכיח כי שיטת בורג מדריך היא גישה זולה, לשחזור במיוחד להקמת xenografts תוך גולגולתי. יתר על כן, הוא מספק מודל פיזיולוגיים רלוונטיים אימות אסטרטגיות טיפולית חדשנית לטיפול בסרטן המוח.

Watch this Scientific Journal Video about A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice at JoVE.com

A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

כדי להעריך פרדיגמות טיפולית חדשנית לטיפול glioma, מודלים פיזיולוגיים חיוניים הרלוונטיים. אנו מנצלים הליך מושתלת בורג מדריך להקמת מודלים xenograft תוך גולגולתי כי הוא מהיר יותר ובטוח יותר מאשר גישות stereotactic.

מדריך פשוט בורג שיטה ללימודי xenograft תוך גולגולתי של עכברים

The grafting of human tumor cells into the brain of immunosuppressed mice is an established method for the study of brain cancers including glioblastoma ...

a-simple-guide-screw-method-for-intracranial-xenograft-studies-in-mice

Research

JoVE Journal

Medicine

22.9K Views.  Monash Institute of Medical Research. כדי להעריך פרדיגמות טיפולית חדשנית לטיפול glioma, מודלים פיזיולוגיים חיוניים הרלוונטיים. אנו מנצלים הליך מושתלת בורג מדריך להקמת מודלים xenograft תוך גולגולתי כי הוא מהיר יותר ובטוח יותר מאשר גישות stereotactic.

Video: A Simple Guide Screw Method for Intracranial Xenograft Studies in Mice

Epidural Intracranial Pressure Measurement in Rats Using a Fiber-optic Pressure Transducer

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and cardiac arrest. This elevation may result in further neurological injury, in the form of transtentorial herniation1,2,3,4, midbrain compression, neurological deficit or increased cerebral infarct2,4. Current therapies are often inadequate to control elevated ICP in the clinical setting5,6,7 . Thus there is a need for accurate methods of ICP measurement in animal models to further our understanding of the basic mechanisms and to develop new treatments for elevated ICP.
In both the clinical and experimental setting ICP cannot be estimated without direct measurement. Several methods of ICP catheter insertion currently exist. Of these the intraventricular catheter has become the clinical 'gold standard' of ICP measurement in humans8. This method involves the partial removal of skull and the instrumentation of the catheter through brain tissue. Consequently, intraventricular catheters have an infection rate of 6-11%9. For this reason, subdural and epidural cannulations have become the preferred methods in animal models of ischemic injury. 
Various ICP measurement techniques have been adapted for animal models, and of these, fluid-filled telemetry catheters10 and solid state catheters are the most frequently used11,12,13,14,15. The fluid-filled systems are prone to developing air bubbles in the line, resulting in false ICP readings. Solid state probes avoid this problem (Figure 1). An additional problem is fitting catheters under the skull or into the ventricles without causing any brain injury that might alter the experimental outcomes. Therefore, we have developed a method that places an ICP catheter contiguous with the epidural space, but avoids the need to insert it between skull and brain. 
An optic fibre pressure catheter (420LP, SAMBA Sensors, Sweden) was used to measure ICP at the epidural location because the location of the pressure sensor (at the very tip of the catheter) was found to produce a high fidelity ICP signal in this model. There are other manufacturers of similar optic fibre technologies13 that may be used with our methodology. Alternative solid state catheters, which have the pressure sensor located at the side of the catheter tip, would not be appropriate for this model as the signal would be dampened by the presence of the monitoring screw. 
Here, we present a relatively simple and accurate method to measure ICP. This method can be used across a wide range of ICP related animal models.

A novel technique to record the pressures within the skull is described. The minimally invasive method uses a fibre-optic pressure sensing system to accurately measure intracranial pressure (ICP) in anaesthetized rats without causing significant brain trauma. The technique may be used in a wide range of experimental models.

מדידת לחץ תוך גולגולתי אפידורל בחולדות באמצעות מתמר סיבים אופטיים לחץ

Elevated intracranial pressure (ICP) is a significant problem in several forms of ischemic brain injury including stroke, traumatic brain injury and ...

A Simple Method of Mouse Lung Intubation

A simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or expensive animal. One of the reasons that this is not done more routinely is that it is relatively difficult, despite there being several published studies that describe ways to achieve it. In this paper we demonstrate a procedure that eliminates one of the major hurdles associated with this intubation, that of visualizing the trachea during the entire time of intubation. The approach uses a 0.5 mm fiberoptic light source that serves as an introducer to direct the intubation cannula into the mouse trachea. We show that it is possible to use this procedure to measure lung mechanics in individual mice over a time course of at least several weeks. The technique can be set up with relatively little expense and expertise, and it can be routinely accomplished with relatively little training. This should make it possible for any laboratory to routinely carry out this intubation, thereby allowing longitudinal studies in individual mice, thereby minimizing the number of mice needed and increasing the statistical power by using each mouse as its own control.

This paper describes a striaghforward and efficient method of intubating mice for pulmonary function measurements or pulmonary instillation, that allows the mice to recover and be studied at later times. The procedure involves an inexpensive fiberoptic light source that directly illuminates the trachea.

שיטה פשוטה של ​​אינטובציה ריאות המאוסות

A  simple procedure to intubate mice for pulmonary function measurements would  have several advantages in longitudinal studies with limited numbers or  ...

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for personalized medicine after stratification, explaining the current interest in developing a reproducible and low-cost xenotransplant model for this disease. The chick chorioallantoic membrane is a natural immunodeficient host capable of sustaining grafted tissues and cells without species-specific restrictions. In addition, it is easily accessed, manipulated and imaged using optical and fluorescence stereomicroscopy. Histology further allows detailed analysis of heterotypic cellular interactions.
This protocol describes in detail the in ovo grafting of the chorioallantoic membrane with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines (Saos-2 and SW1353). The chick survival rates are up to 75%. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior. For localized grafting of single cell suspensions, ECM gel provides significant advantages over inert containment materials. The Ki67 proliferation index is related to the distance of the cells from the surface of the CAM and the duration of application on the CAM, the latter determining a time frame for the addition of therapeutic products.

The In ovo CAM-assay as a Xenograft Model for Sarcoma

The in ovo chorioallantoic membrane (CAM) is grafted with fresh sarcoma-derived tumor tissues, their single cell suspensions, and permanent and transient fluorescently labeled established sarcoma cell lines. The model is used to study graft- (viability, Ki67 proliferation index, necrosis, infiltration) and host (fibroblast infiltration, vascular ingrowth) behavior.

<em&gt; באוב</em&gt; CAM-assay כXenograftmodel לסרקומה

Sarcoma is a very rare disease that is heterogeneous in nature, all hampering the development of new therapies. Sarcoma patients are ideal candidates for ...

Carotid Artery Infusions for Pharmacokinetic and Pharmacodynamic Analysis of Taxanes in Mice

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study model. As the use of mouse models are often a vital step in preclinical drug discovery and drug development1-8, it is necessary to design a system to introduce drugs into mice in a uniform, reproducible manner. Ideally, the system should permit the collection of blood samples at regular intervals over a set time course. The ability to measure drug concentrations by mass-spectrometry, has allowed investigators to follow the changes in plasma drug levels over time in individual mice1, 9, 10. In this study, paclitaxel was introduced into transgenic mice as a continuous arterial infusion over three hours, while blood samples were simultaneously taken by retro-orbital bleeds at set time points. Carotid artery infusions are a potential alternative to jugular vein infusions, when factors such as mammary tumors or other obstructions make jugular infusions impractical. Using this technique, paclitaxel concentrations in plasma and tissue achieved similar levels as compared to jugular infusion. In this tutorial, we will demonstrate how to successfully catheterize the carotid artery by preparing an optimized catheter for the individual mouse model, then show how to insert and secure the catheter into the mouse carotid artery, thread the end of the catheter out through the back of the mouse&#8217;s neck, and hook the mouse to a pump to deliver a controlled rate of drug influx. Multiple low volume retro-orbital bleeds allow for analysis of plasma drug concentrations over time.

This method was developed with the goal of delivering a steady drug solution via the carotid artery, to assess the pharmacokinetics of novel drugs in mouse models.

חליטות עורק הראשי לpharmacokinetic וpharmacodynamic ניתוח של taxanes בעכברים

When proposing the use of a drug, drug combination, or drug delivery into a novel system, one must assess the pharmacokinetics of the drug in the study ...

A Simple Critical-sized Femoral Defect Model in Mice

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all limb bone fractures fail to heal completely due to the extent of the trauma, disease, or age of the patient. Our ability to improve bone regenerative strategies is critically dependent on the ability to mimic serious bone trauma in test animals, but the generation and stabilization of large bone lesions is technically challenging. In most cases, serious long bone trauma is mimicked experimentally by establishing a defect that will not naturally heal. This is achieved by complete removal of a bone segment that is larger than 1.5 times the diameter of the bone cross-section. The bone is then stabilized with a metal implant to maintain proper orientation of the fracture edges and allow for mobility. 
Due to their small size and the fragility of their long bones, establishment of such lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. As such, long bone defect models are confined to rats and larger animals. Nevertheless, mice afford significant research advantages in that they can be genetically modified and bred as immune-compromised strains that do not reject human cells and tissue.
Herein, we demonstrate a technique that facilitates the generation of a segmental defect in mouse femora using standard laboratory and veterinary equipment. With practice, fabrication of the fixation device and surgical implantation is feasible for the majority of trained veterinarians and animal research personnel. Using example data, we also provide methodologies for the quantitative analysis of bone healing for the model.

Animal models are frequently employed to mimic serious bone injury in biomedical research. Due to their small size, establishment of stabilized bone lesions in mice are beyond the capabilities of most research groups. Herein, we describe a simple method for establishing and analyzing experimental femoral defects in mice.

דגם פגם עצם הירך קריטית בגודל פשוט בעכברים

While bone has a remarkable capacity for regeneration, serious bone trauma often results in damage that does not properly heal. In fact, one tenth of all ...

Utilizing an Orally Dissolving Strip for Pharmacological and Toxicological Studies: A Simple and Humane Alternative to Oral Gavage for Animals

Prior to testing novel therapeutics in humans, short and long term preclinical (i.e., animal), repetitive pharmacological and toxicological testing is required. In most cases, the preferred route of administration is via oral delivery. At the present time, oral delivery is mostly accomplished using an oral gavage procedure, in part, because it can achieve consistent and precise dosing in the animal model. Although this method is well established it does have complications that can result in a high rate of animal attrition. To this end, the procedure introduced here describes an alternative to the oral gavage method in which the desired drug is incorporated into a tastant, orally dissolving strip (ODS) that can simply be presented to the test animal where it is then rapidly taken up with minimal manipulation of the test subject. Herein, we demonstrate that preclinical, oral drug delivery using the ODS method represents a safe, convenient, and humane alternative to oral gavage.

The following protocol describes a novel method for chronic oral drug administration using an orally dissolving strip (ODS) in lieu of the more commonly used oral gavage method. We demonstrate that preclinical, oral drug delivery using the ODS method represents a safe, convenient, and humane alternative to oral gavage.

ניצול רצועת מסה בעל פה ללימודים תרופתיים ו טוקסיקולוגי: חלופה פשוטה הומניטרית Gavage האוראלי עבור בעלי חיים

Prior to testing novel therapeutics in humans, short and long term preclinical (i.e., animal), repetitive pharmacological and toxicological testing is ...

An Improved Method for Rapid Intubation of the Trachea in Mice

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity is a commonly used model to study both acute lung injury and fibrosis, and multiple methods have been developed for administering bleomycin (and other toxic agents) into the lungs. However, many of these approaches, such as transtracheal instillation, have inherent drawbacks, including the need for strong anesthetics and survival surgery. This paper reports a quick, reproducible method of intratracheal intubation that involves mild inhaled anesthesia, visualization of the trachea, and the use of a surrogate spirometer to confirm exposure. As a proof of concept, 8-12 week old C57BL/6 mice were administered either 2.0 U/kg of bleomycin or an equivalent volume of PBS, and both damage and fibrotic endpoints were measured post-exposure. This procedure allows researchers to treat a large cohort of mice in a relatively short period with little expense and minimal post-procedure care.

This article presents a rapid and simple method for administering bleomycin directly into the mouse trachea via intubation. Key advantages of this method are that it is highly reproducible, easy to master, and does not require specialized equipment or lengthy recovery times.

שיטה משופרת עבור אינטובציה מהירה של קנה הנשימה של עכברים

Despite some anatomical and physiological differences, mouse models continue to be an essential tool for studying human lung disease. Bleomycin toxicity ...

A Method for Quantifying Upper Limb Performance in Daily Life Using Accelerometers

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. It has become important to measure a person's activities in daily life, and not just measure their capacity for activity in the structured environment of a clinic or laboratory. A wearable sensor that is now enabling measurement of daily movement is the accelerometer. Accelerometers are commercially-available devices resembling large wrist watches that can be worn throughout the day. Data from accelerometers can quantify how the limbs are engaged to perform activities in peoples' homes and communities. This report describes a methodology to collect accelerometry data and turn it into clinically-relevant information. First, data are collected by having the participant wear two accelerometers (one on each wrist) for 24 h or longer. The accelerometry data are then downloaded and processed to produce four different variables that describe key aspects of upper limb activity in daily life: hours of use, use ratio, magnitude ratio, and the bilateral magnitude. Density plots can be constructed that visually represent the data from the 24 h wearing period. The variables and their resultant density plots are highly consistent in neurologically-intact, community-dwelling adults. This striking consistency makes them a useful tool for determining if upper limb daily performance is different from normal. This methodology is appropriate for research studies investigating upper limb dysfunction and interventions designed to improve upper limb performance in daily life in people with stroke and other patient populations. Because of its relative simplicity, it may not be long before it is also incorporated in clinical neurorehabilitation practice.

This protocol describes a method to quantify upper limb performance in daily life using wrist-worn accelerometers.

שיטה לכימות ביצוע גפיים עליונים ב Daily Life בעזרת מדי תאוצה

A key reason for referral to rehabilitation services after stroke and other neurological conditions is to improve one's ability to function in daily life. ...

Observational Study Protocol for Repeated Clinical Examination and Critical Care Ultrasonography Within the Simple Intensive Care Studies

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) may detect adverse events of interventions such as fluid overload at an early stage. The Simple Intensive Care Studies (SICS) is a research line that focuses on the prognostic and diagnostic value of combinations of clinical variables.
The SICS-I specifically focused on the use of clinical variables obtained within 24 h of acute admission for prediction of cardiac output (CO) and mortality. Its sequel, SICS-II, focuses on repeated evaluations during ICU admission. The first clinical examination by trained researchers is performed within 3 h after admission consisting of physical examination and educated guessing. The second clinical examination is performed within 24 h after admission and includes physical examination and educated guessing, biochemical analysis and CCUS assessments of heart, lungs, inferior vena cava (IVC) and kidney. This evaluation is repeated at days 3 and 5 after admission. CCUS images are validated by an independent expert, and all data is registered in an online secured database. Follow-up at 90 days includes registration of complications and survival status according to patient&#39;s medical charts and the municipal person registry. The primary focus of SICS-II is the association between venous congestion and organ dysfunction.
The purpose of publishing this protocol is to provide details on the structure and methods of this on-going prospective observational cohort study allowing answering multiple research questions. The design of the data collection of combined clinical examination and CCUS assessments in critically ill patients are explicated. The SICS-II is open for other centers to participate and is open for other research questions that can be answered with our data.

Structured protocols are necessary to provide answers on research questions in critically ill patients. The Simple Intensive Care Studies (SICS) provides an infrastructure for repeated measurements in critically ill patients including clinical examination, biochemical analysis and ultrasonography. SICS projects have specific focus but the structure is flexible to other investigations.

פרוטוקול מחקר תצפיתי לבדיקה קלינית חוזרת ונשנית וקריטיים אכפת לי בדיקת אולטרה סאונד בתוך הלימודים נמרץ פשוטה

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) ...

A High-Throughput In Situ Method for Estimation of Hepatocyte Nuclear Ploidy in Mice

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as cholangiocytes, myofibroblasts, progenitors and inflammatory cells also indicate chronic liver damage, tissue remodeling and disease progression. In this protocol, we describe a simple high-throughput approach for calculating changes in the cellular composition of the liver that are associated with injury, chronic disease and cancer. We show how information extracted from two-dimensional (2D) tissue sections can be used to quantify and calibrate hepatocyte nuclear ploidy within a sample and enable the user to locate specific ploidy subsets within the liver in situ. Our method requires access to fixed/frozen liver material, basic immunocytochemistry reagents and any standard high-content imaging platform. It serves as a powerful alternative to standard flow cytometry techniques, which require disruption of freshly collected tissue, loss of spatial information and potential disaggregation bias.

We present a robust, cost-effective, and flexible method for measuring changes in hepatocyte number and nuclear ploidy within fixed/cryopreserved tissue samples that does not require flow cytometry. Our approach provides a powerful sample-wide signature of liver cytology ideal for tracking the progression of liver injury and disease.

תפוקה גבוהה בשיטת באתרו להערכת הפטציט הגרעיני בעכברים

When the liver is injured, hepatocyte numbers decrease, while cell size, nuclear size and ploidy increase. The expansion of non-parenchymal cells such as ...