这项工作得到了国立药物滥用中心（011806 P50的DA）和美国军队国防部（W81XWH - 07 - 1 - 0183）中的一部分。

1。打印自定义的miRNA芯片<ol><li>打印芯片的幻灯片，在一所大学或公司使用的芯片的核心设施服务。芯片制造的质量是微阵列实验的成功的最关键因素之一。如果可能的话，尝试一些服务。理想的情况下，人会一次打印50-100幻灯片，和所有的幻灯片看起来相同，具有很好的分离，个别景点，。 </li><li>对于芯片的支持，我们使用的差距II涂层的幻灯片。 </li><li>对于miRNA的探针，我们使用NCode多物种的miRNA微阵列探头设置V2的。 </li><li>溶于3 × SSC在10μM所有的寡核苷酸和异体四上打印的幻灯片。根据GAAPS第二张幻灯片的说明，修复紫外线照射的幻灯片。标签幻灯片用钻石笔，以纪念该地区与印探头方。储存在22 ° C。 </li></ol> 2。样品制备<ol><li>任何方法或试剂可用于分离RNA的，只要它保留了小分子RNA。我们通常使用的Trizol（Invitrogen公司），提取总RNA，令人满意的数量和质量的RNA制剂作为一个260nm一 280nm处读数计量，。 </li><li>对于RNA标记，混合〜25μg总RNA 5&#39; - PCU - DY547 - 3“在1个缓冲区（的50 mM HEPES，pH值7.8，MgCl 2的 20毫米，10微克/ ml的BSA，10％与0.5微克二甲基亚砜）〜20单位T4 RNA连接酶1〜10毫米DTT和〜0.02-0.03终体积为10 × T4 RNA连接酶1对ATP的缓冲补充。 </li><li>允许标签上冰冰箱为2-24小时内进行。用0.3 M醋酸钠和3体积乙醇沉淀RNA。为了有效地结扎和降水超过200毫克/毫升，溶解总RNA，并保持在20μL总结扎量。 <ol><li>如果较少的RNA是，输入的核糖核酸（RNA）和5&#39; - PCU - DY547 - 3“可以缩小。/ LI&gt; <li>如果RNA是很稀，添加酵母tRNA援助降水等的载体。 </li></ol></li><li>合并和标签参考相应的DNA寡核苷酸使用的Alexa Fluor 647核酸标记试剂盒作为杂交过程控制 6 Ulysis哺乳动物的miRNA的一个子集，共有1微克。 Purify的使用CentriSep列的标记的DNA，并在避光保存在-20 ° C </li></ol> 3。芯片杂交<ol><li>首次使用幻灯片，预杂交3 × SSC，0.1％SDS，0.2％为30-60分钟BSA，过滤解决方案在幻灯片在37 ° C。淹没在水中几次，然后在异丙醇他们。干幻灯片使用离心分离机，5分钟的幻灯片在100克的适配器，在22 ° C。 </li></ol>注：我们使用康宁芯片杂交商会和伊利Lifterslips科学的mSeries进行芯片杂交。 <ol start="2"><li>冲洗李fterslips水，然后在乙醇，在空气中干燥前。放置一个芯片杂交室基地内的幻灯片，对幻灯片的顶部lifterslip。 lifterslip将覆盖探头面积，与联系幻灯片相间。 </li><li>在黑暗中，自旋向下沉淀，标记的RNA。用70％乙醇洗一次，空气干燥沉淀。颗粒应偏红。 </li><li>准备杂交溶液中含有400毫米的Na 2 HPO 4 pH值7.0，0.8％BSA，5％SDS，12％甲酰胺 6μL纯化的1/15-1/100，标记的参照DNA（2.4）每RNA样品。添加的引用DNA的数量取决于有多少种不同的寡核苷酸标记（2.4）。如果有超过100个，则需要较少的稀释。 </li><li> 〜60μL杂交液溶解RNA沉淀。 </li><li>加入20μL的水康宁芯片杂交室基地加湿井。 </li><li>添加吨他混合物标记的RNA和参照DNA的幻灯片。使用细吸管尖，轻轻触摸lifterslip边缘，允许的解决方案，进入通过吸lifterslip和幻灯片之间的空间。 </li><li>放置在基地的杂交盒盖，然后密封与金属剪辑室。 </li><li>把整个塑料袋内室，从康宁室卡带。 </li><li>将湿纸巾的容器内室的磁带（S），用保鲜膜覆盖容器内放置了37 °彗星潮湿，细胞培养孵化器〜24小时。这些注意事项（3.6，3.9，3.10），确保杂交液不干燥孵化过程中。 </li></ol> 4。杂交后处理<ol><li>逐一拆开室录音带。淹没幻灯片和其lifterslip 2 × SSC在22 ° C。 lifterslip会自然脱落的幻灯片。将其放置在0.8 × SSC。洗在0.8 × SSC幻灯片两次，然后在0.4 × SSC，总在1-2分钟的3倍。干的幻灯片，使用幻灯片适配器离心机。用清水洗净lifterslips和保存后重新使用。 </li><li>任何合适的扫描仪，如Perkin Elmer公司ScanArray 5000或分子器件的Axon GenePix 4000B芯片扫描仪扫描的幻灯片。在波长接近547 nm和647 nm的扫描，以获得相应的的图像文件。 </li><li>使用BlueFuse，如计划，量化的投入，从4.2图像文件）的像素强度。检查与程序的各个点，以排除进一步审议芯片的异常点。这些异常点通常出现杂交后处理不良的幻灯片打印或幻灯片。 </li><li>如GeneSpring和Excel进行数据分析和演示方案。总的考虑适用于微阵列数据正常化，这超出了本文的范围。 </li><li>一旦获得令人满意的信号自动对焦之三4.3），再用7地带的芯片幻灯片。在水冲洗的幻灯片，然后在预热，1毫米的NaOH和0.1 × SSC在染色盘，在62 ° C浸泡10-20分钟。重复孵化一次。洗幻灯片22几次水，轻轻摇动60分钟° C.干燥的幻灯片，使用离心机，并存储在22 ° C </li><li>要使用可再生的幻灯片，它是没有必要的预杂交再次的。只需由异丙醇水冲洗，干配种前的幻灯片。 </li></ol> 5。代表性的成果： 我们基本上遵循所描述的程序来分析全球数千样本的miRNA的表达，即在许多不同的条件下，从斑马鱼中分离人体标本的RNA。图1显示了一个非常精确和较强的杂交信号，证明对微阵列扫描图像幻灯片。皮尔逊correlati系数之间的技术复制芯片杂交〜0.99 7，说明优秀的重复性。 <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/3250/3250fig1.jpg" /> 图1合成图像扫描的miRNA杂交后的芯片幻灯片。而黄色斑点相同的探针的DNA和RNA的杂交，导致杂交参考DNA，DY547 -标记的RNA样品的绿色斑点，红色斑点。

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	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Chekulaeva, M., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+miRNA-mediated+post-transcriptional+regulation+in+animal+cells.">Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).</li><li>Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+in+human+cancer.">miRNAs in human cancer.</a> J. Pathol. 223, 102-115 (2011).</li><li>Small, E. M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+roles+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology.">Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology.</a> Nature. 469, 336-342 (2011).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripping+custom+microRNA+microarrays+and+the+lessons+learned+about+probe:slide+interactions.">Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions.</a> Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).</li><li>Landgraf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+microRNA+expression+atlas+based+on+small+RNA+library+sequencing.">A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.</a> Cell. 129, 1401-1414 (2007).</li><li>Chiang, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).</li></ol>

没有利益冲突的声明。

尽管深度测序技术的最新进展，芯片仍然是一个可行的选择，为高通量DNA和RNA分析。深度测序相比，微阵列实验比较便宜，一个典型的分子生物学实验室可以执行大部分的实验和数据分析的房子，允许灵活性和节省时间。在未来的芯片可能非常适合集中审问的基因，例如集，全部或在基因组或miRNA的转录因子的一个子集，这里提出相同的原则和程序可以用于定制微阵列实验研究此外miRNA的基因家族...

<table border="1"><tbody><tr><th>项目</th><th>供应商</th><th>目录编号</th><th>评论</th></tr><tr><td> NCode多物种的miRNA微阵列探头设置V2 </td><td> Invitrogen公司</td><td> MIRMPS201 </td><td>设计的基础上miRBase 9.0版（2006年10月）。它包含〜1140未修改，34-44 NT长寡核苷酸作为探针蠕虫，蝇，斑马鱼，小鼠，大鼠，和人类的miRNA，和内部控制探头，如snoRNAs。成熟的miRNA，因此〜44 NT的大小序列互补的miRNA探针的双峰。进行分析，可以从一个特定的基因组（S）的兴趣集中在miRNA的。 </td></tr><tr><td> Trizol法</td><td> Invitrogen公司</td><td> 15596018 </td><td>我们也用丰富，标注的小RNA的一小部分，虽然总RNA样本更快，更容易准备和量化，适合于下游应用，如基因分析。 </td></tr><tr><td> T4 RNA连接酶1 </td><td>新英格兰生物学ABS </td><td> M0204L </td><td></td></tr><tr><td> Ulysis的Alexa Fluor 647核酸标记试剂盒</td><td> Invitrogen公司</td><td> U21660 </td><td>该试剂盒或类似的产品可用于实验RNA样品或对照RNA（而不是控制DNA）以及标签。 </td></tr><tr><td> 5&#39; - PCU - DY547 - 3“ </td><td> Dharmacon </td><td>产品订制</td><td>小RNA的分数可以用同样的标记结扎。 </td></tr><tr><td> CentriSep列</td><td>普林斯顿分离</td><td> CS - 901 </td><td></td></tr><tr><td> GAPSII涂幻灯片</td><td>康宁</td><td> 40004 </td><td>也可能使用其他类型的幻灯片。 </td></tr><tr><td>微阵列杂交商会</td><td>康宁</td><td> 2551或40080 </td><td>其他种杂交室和盖玻片还应工作。使用市售的杂交机可以显著减少杂交时间，例如，1〜2小时。 </td></tr><tr><td> Lifterslips </td><td>钍ermo /伊利科学</td><td> 25X60I - M5439 - 001 - LS </td><td></td></tr><tr><td> BlueFuse </td><td> BlueGenome </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GeneSpring </td><td>安捷伦</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

performing custom microrna microarray experiments

小分子RNA（miRNAs）是一个大家族〜22核苷酸（nt）长的RNA分子，在真核生物中 1广泛表达。复杂的基因组编码至少有数百个miRNA的，这主要是抑制大量的靶基因的转录后2，3的表达。 miRNA的控制范围广泛的生物过程1。此外，miRNA表达的改变已经与人类疾病，如癌症，和miRNA可作为生物标志物疾病和预后4， 5。因此，重要的是理解表达和许多不同的条件下miRNA的功能。 已采用文件miRNA表达的实时PCR技术，基因芯片和深度测序的三个主要方法。的miRNA芯片技术具有高通量的优势，一般较便宜，和大多数的实验和分析的步骤可卡尔IED在分子生物学实验室，在大多数大学，医学院校和相关的医院。在这里，我们描述了一个用于执行自定义的miRNA微阵列实验的方法。一个miRNA探针组将印上产生的miRNA微阵列玻片。 RNA是隔离的使用方法或试剂，保留小分子RNA的物种，然后用荧光染料标记。作为对照，参考相应的DNA寡核苷酸的miRNA的一个子集上，也有不同的荧光染料。参照DNA将成为展示的幻灯片和杂交质量，也将用于数据规范化。 RNA和DNA混合并杂交到芯片的幻灯片，其中包含数据库中的大多数miRNA的探针。洗涤后，幻灯片扫描获取图像，个别点强度量化。这些原始信号将得到进一步的处理和相应的miRNA表达数据分析。微安rray幻灯片可以剥离和再生，以降低芯片的成本和提高的微阵列实验的一致性。相同的原则和程序适用于其他类型的定制微阵列实验。

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Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

一个简单的程序执行自定义的microRNA微阵列实验描述。这些步骤包括隔离RNA，标签的RNA和参照DNA样本，杂交到芯片，芯片扫描，量化和分析杂交信号。

执行自定义的微RNA基因芯片实验

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

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19.4K 次观看.  University of Minnesota. 一个简单的程序执行自定义的microRNA微阵列实验描述。这些步骤包括隔离RNA，标签的RNA和参照DNA样本，杂交到芯片，芯片扫描，量化和分析杂交信号。