העבודה נתמכה בחלקה על ידי המכון הלאומי לשימוש בסמים מרכז (P50 התובע 011,806) ו צבא ארצות הברית מחלקת ההגנה (W81XWH-07-1-0183).

1. הדפסה של microarrays מירנה אישית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הדפס את השקופיות microarray באמצעות מתקן הגרעין שירותי microarray באוניברסיטה או חברה. איכות ייצור microarray היא אחד הגורמים הקריטיים ביותר להצלחה של הניסוי microarray. נסו כמה שירותים במידת האפשר. באופן אידיאלי, אפשר היה להדפיס שקופיות 5-10 בכל פעם, ואת כל השקופיות ייראה זהה, עם כתמים בודדים מופרדים היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת תמיכה microarray, אנו משתמשים פערים שקופיות השנייה מצופה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור בדיקות מירנה, אנו משתמשים NCode Multi-Species מירנה microarray בדיקה קבע V2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את כל oligonucleotides ב 3 x SSC ב 10 מיקרומטר ו quadruply להדפיס אותם על השקופיות. תקן את השקופיות על ידי הקרנה אולטרה סגולה על פי הוראות השקופיות II GAAPS. לייבל השקופית באמצעות עט יהלום לסמן את האזור לצד בדיקות מודפס. חנות ב 22 ° C. </li></ol> 2. לדוגמה הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל שיטהאו מגיב יכול לשמש כדי לבודד RNA, כל עוד היא שומרת RNA קטנים. אנו משתמשים בדרך כלל Trizol (Invitrogen) כדי לחלץ RNA בסך הכל, עם כמות איכות משביעת רצון של ההכנות RNA, כפי שנמדד על ידי 260nm ו 280nm קריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור RNA תיוג, לערבב ~ 25 מיקרוגרם של רנ&quot;א מוחלטת עם 0.5 מיקרוגרם של 5&#39;-PCU-DY547-3 &quot;6 במאגר x 1 (50 HEPES מ&quot;מ, pH 7.8, 20 מ&quot;מ MgCl 2, 10 מיקרוגרם / מ&quot;ל BSA, 10% DMSO) המכיל ~ 20 יחידות T4-RNA האנזים 1, בתוספת ~ 10 mM DTT ו ~ 0.02-0.03 נפח הסופי של 10 x T4 חיץ RNA האנזים 1 עבור ה-ATP. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר תיוג להמשיך על הקרח בתוך המקרר במשך 2-24 שעות. המשקע RNA עם אצטט 0.3 M נתרן 3 כרכים של אתנול. עבור קשירת משקעים יעיל, לפזר RNA סך של מעל 2 מ&quot;ג / מ&quot;ל, ולשמור את נפח קשירת הכולל ב μl 20 ~. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם RNA פחות זמין, כמות קלט 5&#39;-RNA ו-PCU DY547-3 &quot;יכול להיות scaled למטה. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם RNA הוא מאוד דליל, להוסיף המוביל כגון tRNA שמרים לסייע משקעים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב ו התווית מיקרוגרם 1 סך של DNA oligonucleotides התייחסות המקביל משנה של miRNAs יונקים באמצעות Ulysis אלקסה פלואוריד 647 חומצות גרעין תיוג קיט 6 כביקורת על תהליך ההכלאה. לטהר את ה-DNA מסומן באמצעות טור CentriSep ולשמור בחושך ב -20 ° C. </li></ol> 3. Microarray הכלאה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש שקופיות בפעם הראשונה, לפני להכליא את השקופיות בפתרון מסונן של 3 x SSC, 0.1% SDS, BSA 0.2% במשך 30-60 דק &#39;ב 37 ° C. להטביע אותם במים כמה פעמים, אז isopropanol. יבש את השקופיות בעזרת צנטריפוגה עם מתאם שקופיות ב 100 גרם במשך 5 דק &#39;ב 22 ° C. </li></ol> הערה: אנו משתמשים בתאי קורנינג microarray הכלאה ו mSeries אירי של המדעית של Lifterslips לבצע הכלאה microarray. <ol start="2" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את lifterslips במים, אז אתנול, לפני ייבוש באוויר. המקום שקופיות בתוך בסיס קאמרית הכלאה microarray, וכן lifterslip על גבי השקופית. Lifterslip יכסה את אזור הבדיקה, עם רצועות לבן שלה לפנות את השקופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחושך, ספין למטה זירז, רנ&quot;א מסומן. לשטוף את זה פעם אחת עם 70% אתנול, ו אוויר יבש גלולה. גלולה צריך להיות אדמדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הכלאה המכיל 400 mM Na 2 HPO 4 pH 7.0, 0.8% BSA, 5% SDS, לפוראמיד 12% עם 6 μl 1/15-1/100 של מטוהרים, שכותרתו התייחסות DNA (2.4) לדגימה RNA. כמות ה-DNA התייחסות הוסיף תלוי כמה oligonucleotides שונים מסומנים (2.4). אם יש מעל 100, אז דילול פחות נחוץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממיסים את גלולה RNA היטב עם μl 60 ~ הפתרון הכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 μl של מים לכל אחד בארות humidifying על בסיס microarray קורנינג קאמרית הכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף tהוא תערובת של RNA ו-DNA שכותרתו הפניה לשקופית. השתמש טיפ pipet דק, לגעת בעדינות את קצה lifterslip, ולאפשר פתרון להיכנס רווח בין lifterslip והחלק דרך יניקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את מכסה תא הכלאה מעל לבסיס, ואז לאטום את החדר עם קליפים מתכת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את החדר כולו בתוך שקית הפלסטיק שמגיע עם קלטת הקאמרית של קורנינג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את קלטת קאמרית (ים) בתוך מכולה עם מגבת נייר הרטובות; לכסות את המיכל בניילון נצמד ומניחים אותו בתוך 37 ° C לחות, תא תרבות חממה ~ 24 שעות. אלו אמצעי זהירות (3.6, 3.9, 3.10) להבטיח כי הפתרון הכלאה לא להתייבש במהלך הדגירה. </li></ol> 4. פוסט הכלאה עיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפרק את קלטות תא אחד אחד. שקופית לצלול lifterslip שלה 2 x SSC ב 22 ° C. Lifterslip באופן טבעי ליפול השקופיות. המקום בו 0.8 x SSC. לשטוףאת השקופיות ב 0.8 x SSC פעמיים, ואז שלוש פעמים 0.4 x SSC, 1-2 דקות בסך הכל. יבש את השקופיות בעזרת צנטריפוגה עם מתאם שקופיות. שטפו את lifterslips במים ולשמור לשימוש חוזר מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק את השקופיות עם סורק כל מתאים, למשל, פרקין אלמר ScanArray 5000 או מולקולרית התקנים אקסון GenePix סורק 4000B microarray. סריקה באורכי גל קרובים 547 ננומטר 647 ננומטר כדי להשיג את קבצי התמונה המתאימה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש תוכניות כגון BlueFuse לכמת בעוצמות פיקסל קלט, קבצי תמונה מ 4.2). בדוק מקומות מסוימים עם התוכנית להוציא נקודות חריגות על microarrays מתוך שיקול נוסף. אלה כתמים נורמלי בדרך כלל נובעים הדפסה מחליקים מחליקים עניים או טיפול לאחר ההכלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש תוכניות כגון GeneSpring ו-Excel לניתוח נתונים והצגה. שיקולים כלליים לנורמליזציה נתוני microarray חלים, המהווה מעבר להיקף של מאמר זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אותות משביע רצון מתקבלים after 4.3), רצועת שקופיות microarray לשימוש חוזר 7. יש לשטוף את השקופיות במים, לטבול אז מראש חימם, 1 mM NaOH ו 0.1 x SSC בצלחת מכתים ב 62 מעלות צלזיוס במשך 10-20 דקות. חזור על דגירה פעם אחת. לשטוף את השקופיות כמה פעמים במים עד 60 דקות עם רעד עדין על 22 ° C. יבש את השקופיות באמצעות צנטריפוגות, ולאחסן על 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להשתמש מחדש בשקופיות, אין צורך לאשר מראש את להכליא אותם שוב. פשוט לשטוף אותם במים ואחריו isopropanol, ויבש השקופיות ממש לפני ההכלאה. </li></ol> 5. נציג תוצאות: יש לנו בעיקר בעקבות ההליכים המתוארים לפרופיל ביטוי מירנה העולמי אלפי דגימות, כלומר RNAs מבודד דג הזברה כדי הדגימה האדם בתנאים שונים. איור 1 מציג תמונה סרוקה של microarray להפגין אותות הכלאה מדויקת מאוד חזק על שקופית. פירסון correlatiעל מקדמי בין טכני משכפל של הכלאה microarray הם ~ 0.99 7, המציין reproducibility מעולה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/3250/3250fig1.jpg" /> איור 1 תמונה Composite של שקופיות microarray סרוקים מירנה לאחר ההכלאה. כתמים אדומים נבעה הכלאות על ידי ה-DNA התייחסות, כתמים ירוקים מן המדגם RNA DY547 שכותרתו, בעוד כתמים צהובים היו הכלאות על ידי ה-DNA ו-RNA הן על בדיקות זהה.

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Chekulaeva, M., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+miRNA-mediated+post-transcriptional+regulation+in+animal+cells.">Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).</li><li>Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+in+human+cancer.">miRNAs in human cancer.</a> J. Pathol. 223, 102-115 (2011).</li><li>Small, E. M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+roles+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology.">Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology.</a> Nature. 469, 336-342 (2011).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripping+custom+microRNA+microarrays+and+the+lessons+learned+about+probe:slide+interactions.">Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions.</a> Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).</li><li>Landgraf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+microRNA+expression+atlas+based+on+small+RNA+library+sequencing.">A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.</a> Cell. 129, 1401-1414 (2007).</li><li>Chiang, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).</li></ol>

אין ניגודי אינטרסים הכריז.

למרות ההתקדמות עמוק טכנולוגיות רצף, microarray נשאר בחירה מעשית עבור ניתוח תפוקה גבוהה של DNA ו-RNA. בהשוואה רצף עמוק, ניסויים microarray זולים, וכן מעבדה לביולוגיה מולקולרית טיפוסי יכול לבצע את רוב הניסויים ניתוח נתונים בתוך הבית, אשר מאפשר גמישות חוסך זמן. בעתיד, סביר להניח microarra...

<table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><th> פריטים </th><th> מוכר </th><th> מספר קטלוגי </th><th> תגובות </th></tr><tr><td> NCode Multi-Species מירנה microarray בדיקה קבע V2 </td><td> Invitrogen </td><td> MIRMPS201 </td><td> עיצוב המבוסס על miRBase שחרור 9.0 (אוקטובר 2006). הוא מכיל ~ 1140 ללא שינוי, 34-44 oligonucleotides nt עוד בדיקות עבור להטיס תולעת, דג הזברה, עכבר, חולדה, ו miRNAs אדם, ומספר בדיקות בקרה פנימית כגון snoRNAs. בדיקות מירנה הן כפילויות של רצפי משלים miRNAs בוגרת, ומכאן גודל של ~ 44 NT. ניתוח אחד יכול להתמקד miRNAs מן הגנום מסוים (ים) של עניין. </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596018 </td><td> יש לנו גם השתמשו מועשר, חלק קטן RNA תיוג, למרות הכל דגימות רנ&quot;א הם מהירים יותר, קל יותר להכין לכמת מתאים ליישומים במורד כגון ניתוח ה-mRNA. </td></tr><tr><td> T4-RNA האנזים 1 </td><td> ניו אינגלנד Biolשרירי הבטן </td><td> M0204L </td><td></td></tr><tr><td> Ulysis אלקסה פלואוריד 647 ערכת גרעין תיוג חומצה </td><td> Invitrogen </td><td> U21660 </td><td> ערכה זו או מוצרים דומים ניתן להשתמש בתווית ניסיוני דגימות RNA או RNA השליטה (במקום ה-DNA שליטה) גם כן. </td></tr><tr><td> 5&#39;-PCU-DY547-3 &quot; </td><td> Dharmacon </td><td> מותאמים ללקוח </td><td> חלק קטן RNA יכול להיות מתויג באופן דומה על ידי קשירת. </td></tr><tr><td> CentriSep עמודות </td><td> פרינסטון הפרדות </td><td> CS-901 </td><td></td></tr><tr><td> GAPSII מצופה שקופיות </td><td> קורנינג </td><td> 40004 </td><td> סוגים אחרים של שקופיות ניתן להשתמש גם. </td></tr><tr><td> Microarray לתאי הכלאה </td><td> קורנינג </td><td> 2551 או 40080 </td><td> סוגים אחרים של תאים הכלאה ו coverslips צריך גם לעבוד. באמצעות מכונות הכלאה זמינים מסחרית יכולה להפחית באופן משמעותי את זמן הכלאה, למשל, ל ~ 2 שעות. </td></tr><tr><td> Lifterslips </td><td> ה &#39;ermo / אירי מדעי </td><td> 25X60I-M5439-001-LS </td><td></td></tr><tr><td> BlueFuse </td><td> BlueGenome </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GeneSpring </td><td> Agilent </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

performing custom microrna microarray experiments

רנ&quot;א (miRNAs) הם משפחה גדולה של ~ 22 נוקלאוטידים (NT) זמן מולקולות RNA אשר באים לידי ביטוי נרחב אאוקריוטים 1. הגנום מורכב לקודד לפחות מאות miRNAs, אשר בראש ובראשונה לדכא את הביטוי של מספר רב של גני מטרה שלאחר transcriptionally 2, 3. miRNAs לשלוט במגוון רחב של תהליכים ביולוגיים 1. בנוסף, הביטוי מירנה שינה נמצא קשור מחלות אנושיות, כגון סרטן, ואת miRNAs עשוי לשמש סמנים למחלות הפרוגנוזה 4, 5. חשוב, אפוא, להבין את הביטוי פונקציות של miRNAs בתנאים שונים. שלוש הגישות העיקריות היו מועסקים לביטוי פרופיל מירנה: PCR בזמן אמת, microarray, וסדר עמוק. הטכניקה של microarray מירנה יש את היתרון של להיות תפוקה גבוהה, בדרך כלל פחות יקר, ורוב הפעולות הניסוי וניתוח ניתן קארied החוצה במעבדה לביולוגיה מולקולרית במרבית האוניברסיטאות, בתי ספר לרפואה ובתי חולים הקשורים. כאן, אנו מתארים שיטה לביצוע אישית microarray ניסויים מירנה. מערכת בדיקה מירנה יודפסו על שקופיות זכוכית כדי לייצר microarrays מירנה. רנ&quot;א הוא מבודד באמצעות שיטה או מגיב ששומרת קטן מינים RNA, שכותרתו אז עם צבע פלואורסצנטי. כמו שליטה, DNA התייחסות oligonucleotides המקביל משנה של miRNAs מסומנים גם עם צבע פלואורסצנטי שונים. ה-DNA התייחסות ישמש כדי להדגים את האיכות של השקופית ואת ההכלאה ואת ישמש גם לנורמליזציה נתונים. רנ&quot;א ודנ&quot;א הם מעורבים הכלאה לשקופית המכילה microarray בדיקות עבור רוב miRNAs במסד הנתונים. לאחר הכביסה, להחליק את נסרק להשיג תמונות, בעוצמות של מקומות מסוימים לכימות. אותות אלה הגלם יעובדו נוסף ניתח את הנתונים ביטוי miRNAs המקביל. Microaמגלשות rray ניתן הפשיטו מחדש כדי להפחית את העלות של microarrays כדי לשפר את העקביות של ניסויים microarray. אותם עקרונות ונהלים החלות על סוגים אחרים של ניסויים microarray אישית.

Watch this Scientific Journal Video about Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments at JoVE.com

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

הליך פשוט של ביצוע ניסויים אישית microarray microRNA מתואר. הצעדים כוללים בידוד RNA, תיוג RNA ו-DNA התייחסות, והכלאה דגימות כדי microarrays, סורקת את microarrays, כימות וניתוח אותות הכלאה.

ביצוע ניסויים אישית microarray MicroRNA

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

performing-custom-microrna-microarray-experiments

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Views.  University of Minnesota. הליך פשוט של ביצוע ניסויים אישית microarray microRNA מתואר. הצעדים כוללים בידוד RNA, תיוג RNA ו-DNA התייחסות, והכלאה דגימות כדי microarrays, סורקת את microarrays, כימות וניתוח אותות הכלאה.

Video: Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae Ascospore ייצור אוסף לניסויים microarray.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

הכנת Bilayers מלאכותית לניסויים Electrophysiology

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

עיבוד פיין Loblolly PtGen2 cDNA microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Gene Expression גלובל ניתוח באמצעות פלטפורמה דג הזברה microarray oligonucleotide

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray ניתוח עבור Saccharomyces cerevisiae</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

הגנום עורך עם אצבע CompoZr nucleases אישית אבץ (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

MicroRNA<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה לרקמות כליה פורמלין קבועה

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and cardiovascular disease, have been shown to activate tissue and/or cell-specific miRNA expression associated with disease progression. The inhibition of miRNA expression offers the potential for a therapeutic intervention. However, traditional approaches to inhibit miRNAs, employing antagomir oligonucleotides, affect specific miRNA functions upon global delivery. Herein, we present a protocol for the in vivo cardio-specific inhibition of the miR-181 family in a rat model. A miRNA-sponge construct is designed to include 10 repeated anti-miR-181 binding sequences. The cardio-specific &#945;-MHC promoter is cloned into the pEGFP backbone to drive the cardio-specific miR-181 miRNA-sponge expression. To create a stable cell line expressing the miR-181-sponge, myoblast H9c2 cells are transfected with the &#945;-MHC-EGFP-miR-181-sponge construct and sorted by fluorescence-activated cell sorting (FACs) into GFP positive H9c2 cells which are cultured with neomycin (G418). Following stable growth in neomycin, monoclonal cell populations are established by additional FACs and single cell cloning. The resulting myoblast H9c2-miR-181-sponge-GFP cells exhibit a loss of function of miR-181 family members as assessed through the increased expression of miR-181 target proteins and compared to H9c2 cells expressing a scramble non-functional sponge. In addition, we develop a nanovector for the systemic delivery of the miR-181-sponge construct by complexing positively charged liposomal nanoparticles and negatively charged miR-181-sponge plasmids. In vivo imaging of GFP reveals that multiple tail vein injections of a nanovector over a three-week period are able to promote a significant expression of the miR-181-sponge in a cardio-specific manner. Importantly, a loss of miR-181 function is observed in the heart tissue but not in the kidney or the liver. The miRNA-sponge is a powerful method to inhibit tissue-specific miRNA expression. Driving the miRNA-sponge expression from a tissue-specific promoter provides specificity for the miRNA inhibition, which can be confined to a targeted organ or tissue. Furthermore, combining nanovector and miRNA-sponge technologies permits an effective delivery and tissue-specific miRNA inhibition in vivo.

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

Tissue-specific microRNA inhibition is a technology that is underdeveloped in the microRNA field. Herein, we describe a protocol to successfully inhibit the miR-181 microRNA family in myoblast cells from the heart. Nanovector technology is used to deliver a microRNA sponge that demonstrates significant in vivo cardio-specific miR-181 family inhibition.

אין ויוו Nanovector מסירת MicroRNA ספציפי הלב-ספוג

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and ...

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published studies focus on a single miRNA when characterizing the role of small RNAs in cancer. However, ~30%&#160;of human miRNA genes are organized in clustered units that are often co-expressed, indicating a complex and coordinated system of noncoding RNA regulation. A clearer understating of how clustered miRNA networks function cooperatively to regulate tumor growth, cancer aggressiveness, and drug resistance is required before translating noncoding small RNAs to the clinic.
The use of a high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-mediated gene editing procedure has been employed to study the oncogenic role of a genomic cluster of seven miRNA genes located within a locus spanning ~35,000 bp in length in the context of prostate cancer. For this approach, human cancer cell lines were infected with a lentivirus vector for doxycycline (DOX)-inducible Cas9 nuclease grown in DOX-containing medium for 48 h. The cells were subsequently co-transfected with synthetic trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) complexed with genomic site-specific CRISPR RNA (crRNA) oligonucleotides to allow the rapid generation of cancer cell lines carrying the entire miRNA cluster deletion and individual or combination miRNA gene cluster deletions within a single experiment.
The advantages of this high-throughput gene editing system are the ability to avoid time-consuming DNA vector subcloning, the flexibility in transfecting cells with unique guide RNA combinations in a 24-well format, and the lower-cost PCR genotyping using crude cell lysates. Studies using this streamlined approach promise to uncover functional redundancies and synergistic/antagonistic interactions between miRNA cluster members, which will aid in characterizing the complex small noncoding RNA networks involved in human disease and better inform future therapeutic design.

This protocol describes a high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) gene editing workflow for microRNA cluster network analysis that allows the rapid generation of a panel of genetically modified cell lines carrying unique miRNA cluster member deletion combinations as large as 35 kb within a single experiment.

כלי עריכת גנים CRISPR לניתוח רשת אשכולות מיקרו-רנ"א

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

הבהרת המבנה וההתרחשות של גליקן באמצעות פרופיל פולימרי Microarray

Microarray Polymer Profiling (MAPP) for High-Throughput Glycan Analysis

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans and glycoconjugates within a variety of biological samples, including plant and algal tissues, food materials, and human, animal, and microbial samples. Microarray technology underpins the efficacy of this method by providing a miniaturized, high-throughput screening platform, allowing thousands of interactions between glycans and highly specific glycan-directed molecular probes to be characterized concomitantly, using only small amounts of analytes. Constituent glycans are chemically and enzymatically fractionated, before being sequentially extracted from the sample and directly immobilized onto nitrocellulose membranes. The glycan composition is determined by the attachment of specific glycan-recognizing molecular probes to the extorted and printed molecules. MAPP is complementary to conventional glycan analysis techniques, such as monosaccharide and linkage analysis and mass spectrometry. However, glycan-recognizing molecular probes provide insight into the structural configurations of glycans, which can aid in elucidating biological interactions and functional roles.

מחבר זרקור: פרוטוקול MAPP – קידום ניתוח גליקן 

Microarray polymer profiling (MAPP) is a high-throughput technique for compositional analysis of glycans in biological samples.

פרופיל פולימר Microarray (MAPP) לניתוח גליקן בתפוקה גבוהה

Microarray polymer profiling (MAPP) is a robust and reproducible approach to systematically determine the composition and relative abundance of glycans ...