Работа выполнена при частичной поддержке Национального института наркомании центр (P50 DA 011 806) и Соединенных Штатов армии Министерства обороны (W81XWH-07-1-0183).

1. Печать пользовательских микрочипов микроРНК <ol><li> Печать микрочипов слайды использованием микрочипов основные услуги объекте в университете или компании. Качество изготовления микрочипов является одним из важнейших факторов для успеха эксперимента микрочипов. Попробуйте несколько услуг, если это возможно. В идеале следовало бы напечатать 50-100 слайдов за раз, и все слайды будут выглядеть одинаково, с хорошо разделены, отдельные пятна. </li><li> Для поддержки микрочипов, мы используем ПРОБЕЛЫ II покрытием слайды. </li><li> Для микроРНК зондов, мы используем NCode нескольких видов микроРНК Microarray Зонд Установить V2. </li><li> Растворите все олигонуклеотидов в 3 х SSC при 10 мкМ и четырежды распечатать их на слайдах. Fix слайды ультрафиолетового облучения в соответствии с инструкциями для GAAPS слайды II. Этикетка слайд с пером алмаз, чтобы отметить области, и на стороне печатной зондов. Хранить при температуре 22 ° C. </li></ol> 2. Пробоподготовка <ol><li> Любой методили реагент может быть использован для выделения РНК тех пор, пока она сохраняет малых РНК. Мы обычно используем Trizol (Invitrogen) для извлечения полной РНК, с удовлетворительными количество и качество препаратов РНК, если судить по 260nm и 280 нм чтениях. </li><li> Для РНК маркировки, смешайте ~ 25 мкг общей РНК с 0,5 мкг 5&#39;-PCU-DY547-3 &quot;6 в 1 х буфера (50 мМ HEPES, рН 7,8, 20 мМ MgCl 2, 10 мкг / мл BSA, 10% ДМСО), содержащий ~ 20 единиц Т4 РНК-лигазы 1, дополненные ~ 10 мМ DTT и ~ 0,02-0,03 конечного объема 10 х Т4 РНК-лигазы 1 буфер для АТФ. </li><li> Разрешить маркировки действовать на лед в холодильнике в течение 2-24 часов. Осадок РНК с 0,3 М ацетата натрия и 3 объема этанола. Для эффективного лигирования и осадков, растворяются в общей РНК более 2 мг / мл, и сохранить общий объем лигирования при ~ 20 мкл. <ol><li> Если меньше РНК имеется, количество входных РНК и 5&#39;-PCU-DY547-3 &quot;может быть сокращена. &lt;/ LI&gt; <li> Если РНК очень разбавленных, добавить носитель, такой как дрожжевой тРНК, чтобы помочь в осадках. </li></ol></li><li> Комбинат и этикетки в общей сложности 1 мкг ДНК ссылкой олигонуклеотидов соответствующие подмножества млекопитающих микроРНК использованием Ulysis Alexa Fluor 647 нуклеиновых кислот Kit Маркировка 6, как управление для гибридизации процесса. Purify меченых ДНК с использованием CentriSep колонки и сохранить в темноте при температуре -20 ° С. </li></ol> 3. Microarray гибридизации <ol><li> Чтобы использовать слайды в первый раз, предварительно гибридизации слайды в отфильтрованный раствор 3 х SSC, 0,1% SDS, 0,2% BSA в течение 30-60 минут при температуре 37 ° C. Погрузите их в воду несколько раз, то в изопропанола. Сухой слайды использованием центрифуги с слайд адаптера на 100 г в течение 5 мин при 22 ° C. </li></ol> Примечание: Мы используем Corning микрочипов гибридизации камер и mSeries Эри Научно о Lifterslips выполнять микрочипов гибридизации. <ol start="2"><li> Промыть лиfterslips в воде, затем в этаноле, перед сушкой на воздухе. Место слайд внутри камеры базы гибридизация микрочипов, и lifterslip в верхней части слайда. Lifterslip покроет площадь зонда, с белыми полосами связавшись слайда. </li><li> В темные, спина вниз осаждаются, меченой РНК. Вымойте это когда-то с 70% этанола, и воздух сухой осадок. Гранулы должны быть красноватые. </li><li> Подготовка гибридизации раствора, содержащего 400 мМ Na 2 HPO 4 рН 7,0, 0,8% BSA, 5% SDS, 12% формамида 6 с 1/15-1/100 мкл очищенной, обозначенные ссылкой ДНК (2,4) на пробу РНК. Количество добавленного ссылкой ДНК зависит от того, сколько различных олигонуклеотидов помечены (2,4). Если Есть более чем 100, то меньше разбавления не требуется. </li><li> Растворите гранулы РНК хорошо с ~ 60 мкл гибридизации решение. </li><li> Добавьте 20 мкл воды к каждому из увлажнение скважин в гибридизации Corning база камеры микрочипов. </li><li> Добавить тОн смесь меченых РНК и ДНК ссылкой на слайд. Использование тонкого кончика пипетки, аккуратно прикоснуться к краю lifterslip, и позволяют решение войти в пространство между lifterslip и слайд через всасывания. </li><li> Место гибридизации камеры крышку над базой, то уплотнение камеры с металлическими зажимами. </li><li> Положите все камеры внутри пластиковый пакет, который поставляется с камерой кассету из Corning. </li><li> Место камеры кассету (ы) внутри контейнера с смачивается бумажным полотенцем; крышка контейнера с полиэтиленовой пленкой и поместите его в 37 ° C влажной, культура клеток инкубаторе в течение ~ 24 часов. Эти меры предосторожности (3.6, 3.9, 3.10) обеспечить, чтобы гибридизация решение не высыхает во время инкубации. </li></ol> 4. После гибридизации обработки <ol><li> Разберите камеру кассет по одному. Погрузите слайд и его lifterslip в 2-х SSC при 22 ° C. Lifterslip естественно падать слайда. Поместите его в 0,8 х SSC. Мытьслайды в 0,8 х SSC два раза, затем три раза в 0,4 х SSC, 1-2 мин в общей сложности. Сухой слайды использованием центрифуги с слайд адаптером. Вымойте lifterslips с водой и сохранить для повторного использования в последующем. </li><li> Сканирование слайдов с любым подходящим сканером, например, Perkin Elmer ScanArray 5000 или Molecular Devices Axon GenePix 4000B микрочипов сканера. Проверка при длинах волн, близких к 547 нм и 647 нм для получения соответствующих файлов изображений. </li><li> Использование таких программ, как BlueFuse количественно интенсивности пикселов на входе, файлы изображений из 4.2). Осмотрите отдельных пятен с программой, чтобы исключить ненормальных пятен на микрочипы из дальнейшего рассмотрения. Эти аномальные пятна обычно возникают из бедных печать слайдов или слайд-обработки после гибридизации. </li><li> Использование таких программ, как GeneSpring и Excel для анализа данных и представления данных. Общие соображения для нормализации микрочипов данные относятся, которая выходит за рамки данной статьи. </li><li> После удовлетворительного сигналы получаются афтер 4,3), стрип-микрочипов слайды для повторного использования 7. Промыть слайды в воде, затем погрузите в подогретого, 1 мМ NaOH и 0,1 х SSC в сосуд для окрашивания на 62 ° С в течение 10-20 минут. Повторите инкубации один раз. Вымойте слайды несколько раз в воде в течение до 60 минут с осторожном встряхивании при 22 ° C. Сухой слайды использованием центрифуг, и храните при температуре 22 ° C. </li><li> Для использования регенерированного слайды, не стоит предварительно скрещивать их снова. Просто промыть их в воде следует изопропанол, и сухие слайды прямо перед гибридизации. </li></ol> 5. Представитель Результаты: У нас в основном соответствует описанной процедуры в профиль глобальной выражение микроРНК в тысячах образцов, т. е. РНК изолирован от данио рерио, чтобы человеческий образец под различными условиями. На рисунке 1 показано отсканированное изображение микрочипов, чтобы продемонстрировать очень точные и сильные сигналы гибридизации на слайда. Пирсон correlatiо коэффициентах между техническими повторов микрочипов гибридизации ~ 0,99 7, что указывает на отличную воспроизводимость. <img alt="Рисунок 1" src="/files/ftp_upload/3250/3250fig1.jpg" /> Рисунок 1 композитный образ отсканированного слайда микрочипов микроРНК после гибридизации. Красные пятна в результате гибридизации ссылкой ДНК, зеленые пятна от DY547 меченных образцов РНК, в то время как желтые пятна были от гибридизации как ДНК и РНК, к тому же зондов.

<ol>
	<li>Ambros, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+functions+of+animal+microRNAs.">The functions of animal microRNAs.</a> Nature. 431, 350-355 (2004).</li><li>Friedman, R. C., Farh, K. K., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Most+mammalian+mRNAs+are+conserved+targets+of+microRNAs.">Most mammalian mRNAs are conserved targets of microRNAs.</a> Genome Res. 19, 92-105 (2009).</li><li>Chekulaeva, M., Filipowicz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+miRNA-mediated+post-transcriptional+regulation+in+animal+cells.">Mechanisms of miRNA-mediated post-transcriptional regulation in animal cells.</a> Curr. Opin. Cell Biol. 21, 452-460 (2009).</li><li>Farazi, T. A., Spitzer, J. I., Morozov, P., Tuschl, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRNAs+in+human+cancer.">miRNAs in human cancer.</a> J. Pathol. 223, 102-115 (2011).</li><li>Small, E. M., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pervasive+roles+of+microRNAs+in+cardiovascular+biology.">Pervasive roles of microRNAs in cardiovascular biology.</a> Nature. 469, 336-342 (2011).</li><li>Thomson, J. M., Parker, J., Perou, C. M., Hammond, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+custom+microarray+platform+for+analysis+of+microRNA+gene+expression.">A custom microarray platform for analysis of microRNA gene expression.</a> Nat. Methods. 1, 47-53 (2004).</li><li>Zhang, X., Xu, W., Tan, J., Zeng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stripping+custom+microRNA+microarrays+and+the+lessons+learned+about+probe:slide+interactions.">Stripping custom microRNA microarrays and the lessons learned about probe:slide interactions.</a> Anal. Biochem. 386, 222-227 (2009).</li><li>Griffiths-Jones, S., Saini, H. K., van Dongen, S., Enright, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=miRBase:+tools+for+microRNA+genomics.">miRBase: tools for microRNA genomics.</a> Nucl. Acids. Res. 36, D154-D158 (2008).</li><li>Landgraf, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mammalian+microRNA+expression+atlas+based+on+small+RNA+library+sequencing.">A mammalian microRNA expression atlas based on small RNA library sequencing.</a> Cell. 129, 1401-1414 (2007).</li><li>Chiang, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mammalian+microRNAs:+experimental+evaluation+of+novel+and+previously+annotated+genes.">Mammalian microRNAs: experimental evaluation of novel and previously annotated genes.</a> Genes. Dev. 24, 992-1009 (2010).</li></ol>

Нет конфликта интересов объявлены.

Несмотря на последние достижения в области технологий глубокой последовательности, микрочипов остается жизнеспособным выбором для высокопроизводительного анализа ДНК и РНК. По сравнению с глубоким последовательности, микрочипов эксперименты дешевле, а типичные лаборатории молеку?...

<table border="1"><tbody><tr><th> Элементы </th><th> Продавец </th><th> Номер по каталогу </th><th> Комментарии </th></tr><tr><td> NCode нескольких видов микроРНК Microarray Зонд Установить V2 </td><td> Invitrogen </td><td> MIRMPS201 </td><td> Разработанный на основе miRBase выпуска 9.0 (октябрь 2006). Он содержит ~ 1140 без изменений, 34-44 нт долго олигонуклеотидов в качестве зондов для червя, летать, данио, мыши, крысы и человека микро-РНК, и ряд внутренних зондов контроля, таких как snoRNAs. МикроРНК зонды дублетов последовательности дополняют зрелые микроРНК, следовательно, размер ~ 44 NT. Для анализа можно сосредоточиться на микроРНК от конкретного генома (ов), представляющих интерес. </td></tr><tr><td> Trizol </td><td> Invitrogen </td><td> 15596018 </td><td> Мы также использовали обогащается, небольшая часть РНК для маркировки, хотя общая образцов РНК быстрее и проще в приготовлении и количественно и подходит для последующих приложений, таких как мРНК анализа. </td></tr><tr><td> Т4 РНК-лигазы 1 </td><td> Новая Англия Biolабс </td><td> M0204L </td><td></td></tr><tr><td> Ulysis Alexa Fluor 647 нуклеиновых кислот Kit маркировки </td><td> Invitrogen </td><td> U21660 </td><td> Этот комплект или аналогичные продукты могут быть использованы для обозначения экспериментальных образцов РНК или РНК контроля (вместо контроля ДНК), а также. </td></tr><tr><td> 5&#39;-PCU-DY547-3 &#39; </td><td> Dharmacon </td><td> На заказ </td><td> Мелкая фракция РНК может быть так же помечены труб. </td></tr><tr><td> CentriSep столбцов </td><td> Принстон Цветоделение </td><td> CS-901 </td><td></td></tr><tr><td> GAPSII покрытием слайдов </td><td> Гранулирование </td><td> 40004 </td><td> Другие типы слайды могут быть использованы. </td></tr><tr><td> Камеры Microarray гибридизации </td><td> Гранулирование </td><td> 2551 или 40080 </td><td> Другие виды гибридизации камер и покровные также должны работать. Использование имеющихся в продаже машин гибридизация может уменьшить гибридизации время существенно, например, до ~ 2 часа. </td></tr><tr><td> Lifterslips </td><td> ThErmo / Эри Научные </td><td> 25X60I-M5439-001-LS </td><td></td></tr><tr><td> BlueFuse </td><td> BlueGenome </td><td></td><td></td></tr><tr><td> GeneSpring </td><td> Agilent </td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

performing custom microrna microarray experiments

микроРНК (миРНК) являются большой семье ~ 22 нуклеотидов (нт) длинные молекулы РНК, которые широко выражено у эукариот 1. Комплекс генома кодируют по меньшей мере сотни микроРНК, которые в первую очередь ингибирует экспрессию большого числа генов-мишеней после транскрипционно 2, 3. микроРНК контроль широкий спектр биологических процессов 1. Кроме того, изменения выражения микроРНК была связана с человеческими болезнями, такими как рак, и микро-РНК могут служить в качестве биомаркеров заболеваний и прогноз 4, 5. Важно, таким образом, чтобы понять выражения и функции микроРНК под различными условиями. Три основные подходы были использованы в профиль микроРНК выражение: ПЦР в реальном времени, микрочипов, и глубокие секвенирования. Техника микроРНК микрочипов имеет преимущество в том, высокую пропускную способность, как правило, менее дорогие, и большинство экспериментальных и анализ шаги могут быть Каррсамодельное взрывное устройство в лаборатории молекулярной биологии в большинстве университетов, медицинских школ и связанные с ними больницы. Здесь мы опишем метод для выполнения пользовательских экспериментов микрочипов микроРНК. Набор микроРНК зонд будет напечатан на предметные стекла для производства микрочипов микроРНК. РНК выделяли с использованием метода или реагент, который сохраняет мелкие виды РНК, а затем помечены флуоресцентным красителем. В качестве контроля ссылкой ДНК олигонуклеотидов соответствующее подмножество микроРНК также помечены различными флуоресценции красителя. Ссылка ДНК будет служить, чтобы продемонстрировать качество слайдов и гибридизации, а также будут использованы для нормализации данных. РНК и ДНК смешивают и гибридизации с микрочипов слайд, содержащий зонды для большинства из микроРНК в базе данных. После мытья слайд сканируется для получения изображения, и интенсивности отдельных пятен количественно. Эти сигналы сырья будут дополнительно обработаны и проанализированы как выражение данные соответствующего микроРНК. МкАrray слайды могут быть удалены и регенерируется снизить стоимость микрочипов и повысить согласованность микрочипов экспериментов. Те же самые принципы и процедуры применимы к другим типам пользовательских экспериментов микрочипов.

Watch this Scientific Journal Video about Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments at JoVE.com

Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

Простая процедура выполнения пользовательских экспериментов микрочипов микроРНК описывается. Шаги включают в себя выделения РНК, РНК и маркировки ссылкой ДНК гибридизации образцы микрочипов, сканирования микрочипов, количественной оценки и анализа гибридизации сигналов.

Выполнение пользовательских Эксперименты Microarray микроРНК

microRNAs (miRNAs) are a large family of &tilde; 22 nucleotides (nt) long RNA molecules that are widely expressed in eukaryotes 1.  Complex genomes encode ...

performing-custom-microrna-microarray-experiments

Research

JoVE Journal

Biology

19.4K Views.  University of Minnesota. Простая процедура выполнения пользовательских экспериментов микрочипов микроРНК описывается. Шаги включают в себя выделения РНК, РНК и маркировки ссылкой ДНК гибридизации образцы микрочипов, сканирования микрочипов, количественной оценки и анализа гибрид...

Video: Performing Custom MicroRNA Microarray Experiments

Gibberella zeae Ascospore Production and Collection for Microarray Experiments.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain quality. F. graminearum also causes stalk and ear rots of maize and is a producer of mycotoxins such as the trichothecenes that contaminate grain and are harmful to humans and livestock (Goswami and Kistler, 2004).

The fungus produces two types of spores. Ascospores, the propagules resulting from sexual reproduction, are the main source of primary infection.  These spores are forcibly discharged from mature perithecia and dispersed by wind (Francl et al 1999). Secondary infections are mainly caused by macroconidia which are produced by asexual means on the plant surface. To study the developmental processes of ascospores in this fungus, a procedure for their collection in large quantity under sterile conditions was required. Our protocol was filmed in order to generate the highest level of information for understanding and reproducibility; crucial aspects when full genome gene expression profiles are generated and interpreted. In particular, the variability of ascospore germination and biological activity are dependent on the prior manipulation of the material. The use of video for documenting every step in ascospore production is proposed in order to increase standardization, complying with the increasingly stringent requirements for microarray analysis. The procedure requires only standard laboratory equipment. Steps are shown to prevent contamination and favor time synchronization of ascospores.

To study the developmental processes of ascospores in Gibberella zeae, a procedure for collection under sterile conditions is filmed in order to generate the highest level of information for protocol description. This should facilitate the reproducibility of the experiment, a crucial aspect when full genome expression profile tests are implemented.

Gibberella zeae аскоспор Производство и коллекция для Microarray эксперименты.

Fusarium graminearum Schwabe (teleomorph Gibberella zeae) is a plant pathogen causing scab disease on wheat and barley that reduces crop yield and grain ...

Preparation of Artificial Bilayers for Electrophysiology Experiments

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can be used for many different studies, such as the characterization of membrane-active peptides, the reconstitution of ion channels or investigations on how changes in lipid bilayer properties alter the function of bilayer-spanning channels.  Here, we show how to form a planar bilayer and how to isolate small patches from the bilayer, and in a second video  will also demonstrate a procedure for using gramicidin channels to determine changes in lipid bilayer elastic properties.   We also demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. Here, we demonstrate the individual steps needed to prepare the bilayer chamber, the electrodes and how to test that the bilayer is suitable for single-channel measurements.

Подготовка Искусственный Бислои для экспериментов электрофизиологии

Planar lipid bilayers, also called artificial lipid bilayers, allow you to study ion-conducting channels in a well-defined environment. These bilayers can ...

Processing the Loblolly Pine PtGen2 cDNA Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs. The array is produced in our laboratory for use by researchers studying gene expression in pine and other conifer species. PtGen2 was developed as a result of our gene discovery efforts in loblolly pine, and is comprised of sequences identified primarily from root tissues, but also from needle and stem.1,2 PtGen2 has been tested by hybridizing different Cy-dye labeled conifer target cDNAs, using both amplified and non-amplified indirect labeling methods, and also tested with a number of hybridization and washing conditions. This video focuses on the handling and processing of slides before and after pre-hybridization, as well as after hybridization, using some modifications to procedures developed previously.3,4 Also included, in text form only, are the protocols used for the generation, labeling and clean up of target cDNA s, as well as information on software used for downstream data processing. 
PtGen2 is printed with a proprietary print buffer that contains high concentrations of salt that can be difficult to remove completely. The slides are washed first in a warm SDS solution prior to pre-hybridization. After pre-hybridization, the slides are washed vigorously in several changes of water to complete removal of remaining salts. LifterSlips&trade; are then cleaned and positioned on the slides and labeled cDNA is carefully loaded onto the microarray by way of capillary action which provides for even distribution of the sample across the slide, and reduces the chance of bubble incorporation. Hybridization of targets to the array is done at 48&deg;C in high humidity conditions. After hybridization, a series of standard washes are done at 53&deg;C and room temperature for extended times. Processing PtGen2 slides using this technique reduces salt and SDS-derived artifacts often seen when the array is processed less rigorously. Hybridizing targets derived from several different conifer RNA sources, this processing protocol yielded fewer artifacts, reduced background, and provided better consistency among different experimental groups of arrays.

The cDNA microarray PtGen2 was developed for gene expression studies in loblolly pine, P. taeda, and other conifer species. Here, we show pre- and post-hybridization handling and washing techniques that can be used with this array to yield better consistency, reduced artifacts, and lower backgrounds.

Обработка Лоблолли Пайн PtGen2 кДНК Microarray

PtGen2 is a 26,496 feature cDNA microarray containing amplified loblolly pine ESTs.  The array is produced in our laboratory for use by researchers ...

Global Gene Expression Analysis Using a Zebrafish Oligonucleotide Microarray Platform

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray technology is used in numerous biological disciplines in a variety of applications including global gene expression analysis in relation to developmental stage, to a disease state, and in toxic responses. Herein, we include a demonstration of global gene expression analysis using a comprehensive zebrafish-specific oligonucleotide microarray platform. The zebrafish expression microarray platform contains 385,000 probes, 60 base pairs in length, interrogating 37,157 targets with up to 12 probes per target. For this platform, all cDNA and genomic information available for the zebrafish was collected from various genomic databases including Ensembl (http://www.ensembl.org), VEGA (http://vega.sanger.ac.uk), UCSC (http://genome.ucsc.edu), and ZFIN (http://www.zfin.org). As a result this expression array provides complete coverage of the current zebrafish transcriptome. The zebrafish expression microarray was printed by Roche NimbleGen (Madison, WI). This technical demonstration includes the fluorescent labeling of a cDNA product, hybridization of the labeled cDNA product to the microarray platform, and array scanning for signal acquisition using the one color analysis strategy.  

Gene microarrays are powerful tools in gene expression profiling at a genome-wide level. This technology has application in a variety of biological disciplines including developmental biology and toxicology. In this video, we detail a protocol for global gene expression analysis using a comprehensive oligonucleotide microarray platform for the zebrafish.

Глобальный анализ экспрессии генов Использование данио рерио Платформа Microarray олигонуклеотидов

Gene microarray technology permits quantitative measurement and gene expression profiling of transcript levels on a genome-wide basis. Gene microarray ...

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent. In the experiment, yeast is grown for 48 hours in 1/2X YPD broth containing 3X glucose. The culture is split into a control and treated group. The experiment culture is treated with 0.5 mM H2O2 in Hanks Buffered Saline (HBSS) for 1 hour. The control culture is treated with HBSS only. Total RNA is extracted from both cultures and is converted to a biotin-labeled cRNA product through a multistep process. The final synthesis product is taken back to the UVM Microarray Core Facility and hybridized to the Affymetrix yeast GeneChips. The resulting gene expression data are uploaded into bioinformatics data analysis software.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen peroxide (H2O2), an oxidizing agent.

Microarray анализа для Saccharomyces CEREVISIAE</em

In this protocol, gene expression in yeast (Saccharomyces cerevisiae) is changed after exposure to oxidative stress induced by the addition of hydrogen ...

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such as chemical-based mutagenesis or random integration of DNA sequences confer indiscriminate genetic changes in an overall inefficient manner and require incorporation of undesirable synthetic sequences or use of aberrant culture conditions, potentially confusing biological study. By contrast, transient ZFN expression in a cell can facilitate precise, heritable gene editing in a highly efficient manner without the need for administration of chemicals or integration of synthetic transgenes.
Zinc finger nucleases (ZFNs) are enzymes which bind and cut distinct sequences of double-stranded DNA (dsDNA). A functional CompoZr ZFN unit consists of two individual monomeric proteins that bind a DNA "half-site" of approximately 15-18 nucleotides (see Figure 1). When two ZFN monomers "home" to their adjacent target sites the DNA-cleavage domains dimerize and create a double-strand break (DSB) in the DNA.1 Introduction of ZFN-mediated DSBs in the genome lays a foundation for highly efficient genome editing. Imperfect repair of DSBs in a cell via the non-homologous end-joining (NHEJ) DNA repair pathway can result in small insertions and deletions (indels). Creation of indels within the gene coding sequence of a cell can result in frameshift and subsequent functional knockout of a gene locus at high efficiency.2 While this protocol describes the use of ZFNs to create a gene knockout, integration of transgenes may also be conducted via homology-directed repair at the ZFN cut site.
The CompoZr Custom ZFN Service represents a systematic, comprehensive, and well-characterized approach to targeted gene editing for the scientific community with ZFN technology. Sigma scientists work closely with investigators to 1) perform due diligence analysis including analysis of relevant gene structure, biology, and model system pursuant to the project goals, 2) apply this knowledge to develop a sound targeting strategy, 3) then design, build, and functionally validate ZFNs for activity in a relevant cell line. The investigator receives positive control genomic DNA and primers, and ready-to-use ZFN reagents supplied in both plasmid DNA and in-vitro transcribed mRNA format. These reagents may then be delivered for transient expression in the investigator&#x2019;s cell line or cell type of choice. Samples are then tested for gene editing at the locus of interest by standard molecular biology techniques including PCR amplification, enzymatic digest, and electrophoresis. After positive signal for gene editing is detected in the initial population, cells are single-cell cloned and genotyped for identification of mutant clones/alleles.

Genome Editing with CompoZr Custom Zinc Finger Nucleases ZFNs

The CompoZr Custom Zinc-Finger Nuclease (ZFN) Service enables precise genome editing in any organism or cell line at any locus defined by the user. This article describes the process for the design, manufacture, validation and implementation of the CompoZr Custom ZFN Service.

Геном Редактирование с помощью пользовательских CompoZr нуклеаз цинкового пальца (ZFNs)

Genome editing is a powerful technique that can be used to elucidate gene function and the genetic basis of disease. Traditional gene editing methods such ...

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA probes. This protocol, originally developed by Kloosterman and colleagues for broad use with Exiqon miRNA probes1, has been modified to overcome challenges inherent in miRNA analysis in kidney tissues. These include issues such as structure identification and hard to remove residual probe and antibody. Use of relatively thin, 5 mm thick, tissue sections allowed for clear visualization of kidney structures, while a strong probe signal was retained in cells. Additionally, probe concentration and incubation conditions were optimized to facilitate visualization of microRNA expression with low background and nonspecific signal. Here, the optimized protocol is described, covering the initial tissue collection and preparation through the mounting of slides at the end of the procedure. The basic components of this protocol can be altered for application to other tissues and cell culture models.

MicroRNA In situ Hybridization for Formalin Fixed Kidney Tissues

This article describes an in situ hybridization protocol optimized for colormetric detection of microRNA expression in formalin fixed kidney sections.

МикроРНК<em&gt; В месте</em&gt; Гибридизация на формалин ткани почки

In this article we describe a method for colorimetric detection of miRNA in the kidney through in situ hybridization with digoxigenin tagged microRNA ...

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and cardiovascular disease, have been shown to activate tissue and/or cell-specific miRNA expression associated with disease progression. The inhibition of miRNA expression offers the potential for a therapeutic intervention. However, traditional approaches to inhibit miRNAs, employing antagomir oligonucleotides, affect specific miRNA functions upon global delivery. Herein, we present a protocol for the in vivo cardio-specific inhibition of the miR-181 family in a rat model. A miRNA-sponge construct is designed to include 10 repeated anti-miR-181 binding sequences. The cardio-specific &#945;-MHC promoter is cloned into the pEGFP backbone to drive the cardio-specific miR-181 miRNA-sponge expression. To create a stable cell line expressing the miR-181-sponge, myoblast H9c2 cells are transfected with the &#945;-MHC-EGFP-miR-181-sponge construct and sorted by fluorescence-activated cell sorting (FACs) into GFP positive H9c2 cells which are cultured with neomycin (G418). Following stable growth in neomycin, monoclonal cell populations are established by additional FACs and single cell cloning. The resulting myoblast H9c2-miR-181-sponge-GFP cells exhibit a loss of function of miR-181 family members as assessed through the increased expression of miR-181 target proteins and compared to H9c2 cells expressing a scramble non-functional sponge. In addition, we develop a nanovector for the systemic delivery of the miR-181-sponge construct by complexing positively charged liposomal nanoparticles and negatively charged miR-181-sponge plasmids. In vivo imaging of GFP reveals that multiple tail vein injections of a nanovector over a three-week period are able to promote a significant expression of the miR-181-sponge in a cardio-specific manner. Importantly, a loss of miR-181 function is observed in the heart tissue but not in the kidney or the liver. The miRNA-sponge is a powerful method to inhibit tissue-specific miRNA expression. Driving the miRNA-sponge expression from a tissue-specific promoter provides specificity for the miRNA inhibition, which can be confined to a targeted organ or tissue. Furthermore, combining nanovector and miRNA-sponge technologies permits an effective delivery and tissue-specific miRNA inhibition in vivo.

In Vivo Nanovector Delivery of a Heart-specific MicroRNA-sponge

Tissue-specific microRNA inhibition is a technology that is underdeveloped in the microRNA field. Herein, we describe a protocol to successfully inhibit the miR-181 microRNA family in myoblast cells from the heart. Nanovector technology is used to deliver a microRNA sponge that demonstrates significant in vivo cardio-specific miR-181 family inhibition.

В естественных условиях Nanovector поставка сердца конкретных микроРНК Губка

MicroRNA (miRNA) is small non-coding RNA which inhibits post-transcriptional messenger RNA (mRNA) expression. Human diseases, such as cancer and ...

CRISPR Gene Editing Tool for MicroRNA Cluster Network Analysis

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published studies focus on a single miRNA when characterizing the role of small RNAs in cancer. However, ~30%&#160;of human miRNA genes are organized in clustered units that are often co-expressed, indicating a complex and coordinated system of noncoding RNA regulation. A clearer understating of how clustered miRNA networks function cooperatively to regulate tumor growth, cancer aggressiveness, and drug resistance is required before translating noncoding small RNAs to the clinic.
The use of a high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)-mediated gene editing procedure has been employed to study the oncogenic role of a genomic cluster of seven miRNA genes located within a locus spanning ~35,000 bp in length in the context of prostate cancer. For this approach, human cancer cell lines were infected with a lentivirus vector for doxycycline (DOX)-inducible Cas9 nuclease grown in DOX-containing medium for 48 h. The cells were subsequently co-transfected with synthetic trans-activating CRISPR RNA (tracrRNA) complexed with genomic site-specific CRISPR RNA (crRNA) oligonucleotides to allow the rapid generation of cancer cell lines carrying the entire miRNA cluster deletion and individual or combination miRNA gene cluster deletions within a single experiment.
The advantages of this high-throughput gene editing system are the ability to avoid time-consuming DNA vector subcloning, the flexibility in transfecting cells with unique guide RNA combinations in a 24-well format, and the lower-cost PCR genotyping using crude cell lysates. Studies using this streamlined approach promise to uncover functional redundancies and synergistic/antagonistic interactions between miRNA cluster members, which will aid in characterizing the complex small noncoding RNA networks involved in human disease and better inform future therapeutic design.

This protocol describes a high-throughput clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR) gene editing workflow for microRNA cluster network analysis that allows the rapid generation of a panel of genetically modified cell lines carrying unique miRNA cluster member deletion combinations as large as 35 kb within a single experiment.

Инструмент редактирования генов CRISPR для анализа сети кластеров микроРНК

MicroRNAs (miRNAs) have emerged as important cellular regulators (tumor suppressors, pro-oncogenic factors) of cancer and metastasis. Most published ...

Performing Muscle Cryoinjury on a Zebrafish

For performing the myomere cryoinjury on zebrafish, use a custom manufactured stainless steel cryoprobe. To avoid frostbite while handling the probe during the procedure, insert the probe handle into a pipette tip and secure it by wrapping it with tape. Before beginning with the cryoinjury procedure, prepare a beaker for the anesthesia working solution, a spoon for handling the fish, a moist sponge, and a tank with system water for post-procedure recovery of the fish.Prepare the anesthesia stock solution following the steps shown on the screen. Then add four milliliters of the prepared stock solution to 100 milliliters of system water in a beaker to prepare the tricaine working solution. To begin the cryoinjury procedure, immerse the probe in liquid nitrogen for a minimum of three minutes.Wet the sponge in system water and place it on a flat surface. Then one to two minutes after transferring a single adult zebrafish into the tricaine working solution, confirm its unresponsiveness by touching the fish gently with the spoon. Place the anesthetized fish onto the wet sponge.Locate the caudal peduncle posterior to the anal fin and anterior to the caudal fin. At this stage, remove the cryoprobe from the liquid nitrogen. Shake the probe gently to ensure no residual liquid nitrogen remains on the tip.Place the edge of the spatula perpendicular to the body on the caudal peduncle. Keep the probe in this position for six seconds without applying pressure, before releasing the cryoprobe from the tissue. Then transfer the fish into the system water in the recovery tank.Monitor the fish while it resumes breathing and swimming after waking up from the anesthesia. If opercular movements do not occur after 30 seconds, stimulate the fish by pipetting system water into the gills until the animal initiates respiration by itself. Video recording of control and cryoinjured fish at one day post-injury or DPCI revealed that although the cryoinjured fish swam less actively, they did not display any abnormal movements, such as swirling, convolution, or reduced equilibrium.In the husbandry system, their position in the tank and food intake was similar to those of the uninjured fish. As observed at 5 DPCI, normal behavior was still persistent indicating the cryoinjury procedure did not severely affect the wellbeing of the animals.