我们已经表明，第四组病毒基因组编码短段宿主蛋白质序列。这些序列可以在病毒蛋白酶裂解位点内找到。它们被用于靶向宿主蛋白质的定向破坏，这些蛋白质通常是参与产生免疫反应的蛋白质。
使用蛋白酶测定的一个主要优点是，它消除了细胞的复杂性，并表明病毒蛋白酶是否可以切割特定的序列。因此，当我们分析寨卡SSHHPS序列时，我们发现蛋白酶可以切割参与产生免疫反应的蛋白质序列，其中一些蛋白质在大脑和眼睛发育中也有作用。首次执行此技术时，应记住，如果不观察到裂痕，则可能是由于多种因素（如蛋白酶的活性）造成的。
演示这个程序的将是海梅·康普顿，一个来自我实验室的技术人员。首先打开蛋白质 BLAST，将 20 个氨基酸围绕剪刀键和病毒多蛋白，并选择非冗余蛋白质序列，然后键入要搜索的宿主基因组。如果需要，选择 PHI-BLAST 并键入一个模式序列，其中方括号指示括号内的任一氨基酸可以处于替代位置，然后命中 BLAST。
根据与裂解站点序列匹配的连续相同或耐受残留物数对 BLAST 命中进行排名。从列表中，选择含有六种或更多相同或类似残留物的蛋白质，用于蛋白酶测定中的分析。构建一个质粒编码的青色荧光蛋白，高达25个氨基酸的裂解序列，和黄色荧光蛋白。
接下来，通过接种四个四升烧瓶和 25 毫升的隔夜培养物来准备 CFP 和 YFP 基板。在 37 摄氏度下摇动培养物，每小时通过 UV-Vis 光谱仪监测 600 纳米的生长情况。当细菌达到约一个的吸收度时，通过在每个烧瓶中加入0.5毫升的摩尔IPTG来诱导蛋白质表达，然后将摇动培养箱的温度降低至17摄氏度，让这种表达在一夜之间持续17至20个小时。
第二天，在4摄氏度下，以7000次g的离心对细菌进行10分钟。取出并丢弃液体介质，然后在零下 80 摄氏度下储存颗粒，然后进行细胞解解。要对细胞进行解液，根据手稿指示准备100毫升的解液缓冲液，在缓冲液中重新悬浮颗粒，将25至25毫升悬浮液转移到50毫升一次性锥形管中。
将管子与冰水一起放入塑料烧杯中，然后将声波尖端插入管中，使尖端离管底约一厘米，将酸盐声波化 10 到 20 次，直到其变得液体和液化。声波化后，将酸盐转移到高速离心管中，并在 4 摄氏度下以 20，500 x g 离心，30 分钟。将上清液转移到干净的瓶子中，然后丢弃颗粒。
将落酸装载到镍柱上，然后用两列缓冲器 A 洗涤柱，然后用 280 纳米的五列卷 20% 缓冲液 B。继续清洗，直到 A280 返回到基线值。然后用两到三列体积100%缓冲B来分解蛋白质，并收集10毫升的馏分，确保测量每个分数的S280。
根据手稿方向准备八个反应混合，将每个混合液的移液器 45 微升混合成黑色半区 96 孔板每排前三口。设置板读卡器，通过固定的光电倍增管设置同时检测两个波长的荧光。将读取时间编程为 20 到 30 分钟，每分钟读取一次，然后选择要读取的井。
将板插入机器并启动读取，监测一段时间的排放比。运行包含未切割基板的板的端点读取。将盘子和移液器将五微升酶放入每个井中。
可以将第一列另存为未切割控件。然后再次读取板 20 到 30 分钟，确保将板读取器设置为输出绝对值。读取完成后，用薄膜密封板以防止蒸发，并在室温下过夜，使酶完全切割基板。
24 小时后，取出薄膜并执行板的端点读取。平均排放比，并记录为切割。使用 SDS-PAGE 确认基板的裂解。
将分子量标记加载到第一或最后一个通道中，将每个反应混合物的五微升加载到凝胶的通道中，从未切割反应开始。将凝胶罐的电极连接到电源，以 110 伏运行产品 60 分钟。使用开裂工具从盒式磁带上取出凝胶，并将其淹没在 5 到 10 毫升染色溶液中。
1 至 24 小时后，去除多余的污渍，将凝胶淹没在水中。然后使用凝胶成像器拍摄凝胶的照片。要准备蛋白质结构，请将蛋白质PDB文件加载到MOE中。
单击"选择"和"溶剂"，然后删除溶剂。从"计算"顶部菜单栏打开"结构准备"面板，然后单击"正确"自动更正所有结构项。通过单击质子 3D 来质子化结构。
通过打开"部分电荷"面板并选择 AMBER 99 并根据需要调整氢气和孤对，向蛋白质添加部分电荷。然后保存结构文件。要构建基质肽和 TRIM14 的结构，请打开蛋白质构建器面板，输入基板序列，然后选择自动重新包装。
接下来，将几何设置为"扩展"，然后单击"生成"。最后最小化结构并将其保存为 PDB 文件。使用 PyRx AudoDock 4.2 软件将基底肽与 VEEV-nsP2 对接。
加载蛋白质，右键单击名称，然后选择"使宏分子"准备 PDBQT 停靠文件。然后加载基板分子并选择"使利贡"来准备配体对接文件。在底部的对接面板上启动"自动停靠"向导，然后选择准备好的配体和蛋白质文件。
通过手动调整网格尺寸，然后运行 AuotGrid 来定义蛋白质结合口袋。接下来，运行自动多克并选择拉马克遗传算法方法。单击停靠参数，将 GA 运行数设置为 50，然后单击"前进"以启动停靠运行。
自动停靠完成后，打开"分析结果"面板并检查所有预测的绑定姿势。选择预测约束能量最低的最佳模型，选择在裂解站点上的cis-477和基板之间的合理结合相互作用，然后将其保存为PDB文件，用于进一步的MD模拟。在阅读 AutoDock 的绑定姿势后，执行停靠后分析以识别使用 MD 模拟进行优化的似是而非绑定模型非常重要。
该协议用于在寨卡病毒ns2B/3蛋白酶中查找短段同源宿主-病原体蛋白序列或SSHHPS。确定了四个宿主蛋白靶点。Foxgs， Sfrp1， 来自视网膜 cdna 库的 Gsalpha 亚单位， 和 Nt5m 线粒体 5'3' 核苷酸。
SSHHPS 的序列对齐允许在裂解位点序列中存在物种特定的差异。SFRP1序列在人类和鸡中是相同的，这是值得注意的，因为寨卡病毒可以诱发死亡和鸡胚胎小头症。连续测定用于测量病毒多蛋白序列的稳定状态动力学参数和抑制常数，用于获取定性裂解信息，如特定序列的裂解或各种化合物抑制蛋白酶。
用硅法制作了委内瑞拉马脑炎 nsP1-nsP2 结的模型。对于 nsP2 蛋白酶，延长基板序列并降低缓冲液的离子强度，导致 Semliki 森林病毒序列裂解的 Michaelis 常数显著降低。尝试此过程时，运行控件非常重要。
在进行SSHHPS序列分析之前，应先测试含有病毒蛋白酶裂解位点序列的基底。如果观察到宿主蛋白的裂解，应进行后续实验，以确认宿主蛋白影响病毒复制。这可以通过过度表达或沉默蛋白质，然后检查对病毒复制的影响。
第四组含有大量新的和正在出现的病原体。SSHHPS序列以非常可预测的方式将特定的宿主蛋白和通路与病毒蛋白酶联系起来。
