我们从一个杜克大学大学学院院长的暑期研究奖学金（AN），美国心脏协会（AHA）奖学金11POST7160006（CG），美国国立卫生研究院（NIH）拨款R01-EY021872从国家眼科研究所（EED），R01HD04260从承认支持国立儿童健康和发展研究所（NK），R01DK072301 R01DK075972从国家糖尿病消化和肾脏疾病研究所（NK），欧洲联盟（欧盟​​7 日 FP资助下GA NR。241955，项目SYSCILIA; EED NK）NK是一个杰出的吉恩和乔治·W·布伦利教授。

1。生物信息学分析<ol><li>确定人类基因的斑马鱼的同源基因，如果是这样，多少份。我们建议互惠的的BLAST（ <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/</a> ）人的蛋白质对斑马鱼的基因组中，最好的斑马鱼撞到了人类基因组和随后爆炸。真同源将是最好的打在每个实例。 </li><li>确定人类基因的开放阅读框（ORF）的大小。如果超过6 KB，这种模式是目前棘手的，因为长的模板体外转录的高品质的局限性。 </li><li>获取或生成一个结构，其中包含人类ORF PCS2 +载体骨架（或等效，5&#39;有SP6转录位点和3&#39;多聚腺苷酸信号的向量）。 </li><li>设计一个MO阻止有针对性的斑马鱼基因的剪接或翻译。如果存在多个副本在斑马鱼的基因组中，有E是两个选项：a）额外MOS设计或b）完全保守的副本之间的剪接位点的识别对单一MO可以有效。一些出版MO序列提供<a href="http://www.zfin.org" target="_blank">www.zfin.org</a> 。 </li></ol> 2。发展的斑马鱼胚胎中的表达分析<ol><li>确定是否在斑马鱼的直向同源物在时空上下文相关的表型读出表示。如果没有感兴趣的基因表达数据，进行逆转录（RT）-PCR方法从整个斑马鱼胚胎或原位杂交基因。 （见图2,3）。 </li></ol> 3。定点突变<ol><li>设计诱变引物，25〜45个碱基的长度，在中心与所需的突变。的引物的熔融温度应大于或等于78℃。设计一个正向和反向的诱变引物退火到相反链的质粒。 </li><li>得到的引物序列的ORF诱变后确认，这些跨〜300个碱基对的部分，以覆盖整个ORF的瓷砖。 </li><li>组装诱变反应与一个高保真聚合酶和周期如下：（1：95℃30秒，2：95℃30秒，3：55℃1分钟，4：68℃，6分钟，5： 2 18X，6：4°C天长地久，7月底）。 </li><li>加入1微升DpnI限制性内切酶每反应除去坝甲基化模板;在37°C孵育2小时。 </li><li>根据标准的协议变换的2微升到20微升的感受态细胞的诱变反应。 </li><li>挑选3-4个菌落，接种5毫升含有适当抗生素的LB培养基。在225转摇在37℃过夜。 </li><li>少量的DNA，并确定浓度。 </li><li>序列的突变位点，确定感兴趣的突变的存在。 </li><li>整个ORF序列确认序列的完整性。 </li></ol> （4） 在体外的mRNA转录<ol><li>使用一个线性PCS2的+模板，生成皑皑的mRNA使用mMessage mMachine SP6试剂盒（Ambion公司）。我们建议使用反应元件数量的一半。 </li><li>与氯化锂沉淀或试剂盒说明书中所描述的酚 - 氯仿纯化的RNA样品。 </li><li>确定使用的吸光度的mRNA的浓度，确保使用凝胶电泳的mRNA的完整性，并在三个或更多的等分试样在-80℃下储存样品，直到准备使用。我们不建议多个冻融循环的mRNA等分。 </li></ol> 5， 在体内含量的变异功能丧失<ol><li>从天然斑马鱼交配获得斑马鱼胚胎，并保持在28°C在胚胎水在6或10厘米的菜。 </li><li>进行吗啉的剂量反应曲线来评估型特异性，MO效率和MO毒性的。注入剂量曲线至少有三种不同的浓度成50-100（1-4细胞阶段）斑马鱼胚胎/批1-10纳克MO之间。高效的MO产生剂量依赖性的增加的比例在一个批处理中受影响的胚胎。 </li><li>在适当的表型胚胎发育阶段的基础上针对性的斑马鱼基因表达的兴趣和在哪个阶段，将观察相关表型。这可以是定量的（如解剖结构之间的测量）或质量（基于标准化的表型标准）。所有注射得分&gt; 24 HPF：胚胎应被视为与PTU（0.003％1 - 苯基-2 - 硫脲在胚胎媒体）在24 HPF最大限度地减少黑色素细胞的形成。 </li><li>对于拼接 - 阻塞的MO中，通过提取总RNA的全胚胎裂解物试验MO效率的表型的得分在时间点，产生的cDNA的靶基因侧翼MO目标站点的使用引物进行RT-PCR检测。 </li><li>要验证压制EFFICiency的TB-MO，收获全胚胎蛋白裂解，并进行免疫比较有针对性的蛋白质与控制水平。然而，这种方法不适合于所有的靶基因，因为是有限的为许多商业斑马鱼的蛋白质的抗体的交叉反应性。表示MO特异性的间接方法，包括：一）证明，有一个对表型的剂量依赖效应;和b）示出野生型的mRNA与tb的-MO，共注射有效抢救的表型。出于这些原因，我们建议拼接阻滞剂时可能的，因为可以直接监控效率。 </li><li>如果观察到的表型进行到步骤5.7，如果没有观察到的表型进行到步骤6.1。 </li><li>对于定性的表型，选择一个MO剂量50-75％的胚胎受到影响;定量表型，选择一个MO剂量表型的措施是显着不同的野生型（P &lt;0.001）。注入新的批次斑马鱼EMBryos（1-4细胞; N = 50-100/batch）位置与MO的“试验”剂量和剂量曲线的人体重量的mRNA（范围从10-200皮克表达的鸡尾酒;这些剂量，以确保大幅度过度表达上述任何单一的成绩单的基线，占多聚腺苷酸总mRNA在斑马鱼胚胎的0.25-0.5％）。 </li><li>注射批次进行屏蔽的得分;选择WT mRNA的剂量在比较MO单独的最显着的救援，这是“试验”剂量的mRNA。 </li><li> MO和人类突变基因检测剂量测定剂量注入新的批次（1-4细胞阶段; N = 50-100/batch时）。表型的胚胎在适当阶段和比较结果WT的人类mRNA的救援用适当的统计检验（t检验或卡方）。参见图1，结果及进行第7步。注入试验剂量WT和突变基因控制基因毒性效应。 </li></ol> 6。 在体内含量的变异DOMinant负增益功能的影响<ol><li>如果没有损失的功能表型观察（步骤5.5），或者如果突变基因产生的表型没有显着不同的从MO单独（步骤5.7），注入剂量曲线从10-200皮克WT人类基因（我们建议25，50作为初始试验，100皮克）成胚胎批次（1-4细胞期50-100胚胎/批次）。 </li><li>在适当的阶段（见5.3段），进行表型得分，并确定最高剂量是没有注射的对照组比较有统计学显着数量的死亡和/或受影响的胚胎。这是“试验”剂量。 </li><li>注入检测人类基因突变剂量（1-4细胞期50-100胚胎/批次）。表型胚胎和比较WT人类基因注射或检测MO浓度的测定剂量得分。参见图1的结果。 </li><li>如果结果是无法区分从MO，滴定人类的突变mRNA与WT表达比较人类WT和突变的mRNA注射。表型与突变加上WT的mRNA注入批次的改进表示了显性负。没有改善表示增益功能。 </li></ol> 7。 体内试验结果重现<ol><li> 在体内试验中重复一个最低的3倍。 </li></ol> 8。与其他行的证据，斑马鱼体内的致病性数据整合<ol><li>致病性比较从斑马鱼实验获得的数据：遗传谱系内的数据（如适用），控制人口的频率数据， 体外研究（基于细胞的检测蛋白质的稳定性，细胞定位，信号输出，或酶活性）。 </li></ol>

作者宣称，他们有没有竞争经济利益。

这里描述的方法表示的一般协议，适用于非同义变化与人类遗传病的表型（ 表2，图3）的各种测定。我们的方法已被证明可用于评价疾病表型变异的潜在影响，并帮助剖析疾病的机制（如显性负突变Bardet-Biedl综合征的贡献，主要是常染色体隐性遗传疾病，17）。迄今为止，通过所提出的决策树的发展，我们已以合理的成本和时间超过200个基因与遗传性疾病的因果关系模型，过量的1,000个等位基因。 虽然没有在这里详细讨论，我们也表明这些方法是适当的其他类型的遗传病变，如拷贝数变异（CNVs），以及和遗传相互作用模型。这类事件的分析范围之外本方法的描述，虽然他们从根本上依赖于系统的测试原理相同的候选基因（包括对基因同时注入），以确定适合临床表型诱导或加重。例如，要澄清的29个基因在16p11.2 CNV可能会对相关头畸形所观察到的在重复的660 kb的基因组分部患者中观察到，每个段内的29个基因的mRNA的相对应的注入和头部2 DPF和DPF进行尺寸测量，一个单一的成绩单，KCTD13揭示了重大贡献。21此外，我们已经使用这个模型来检测基因病变的遗传相互作用Bardet Biedl综合征和先天性巨结肠症的患者22 MO抑制的因果基因的两个临床身份分别和同时通过比较，我们能够识别所得到的表型为贝纳克的协同互动，而不是仅仅添加剂的严重性。 尽管建立了高灵敏度（98％）和特异性（&gt; 82％）有助于ciliopathies 17的变种，我们尚未有足够的数据，以确定是否这些都是推广到在斑马鱼模型中的所有表型的读数。要做到这一点，有大量的等位基因，基因预测是良性的或致病的，必须进行测试，在每个表型类别之内。这种检测在临床上实施，这将是尤为重要，其中功能解释VUSs可以告知只有充分理解这样的结果给医生和患者的假阳性和假阴性，可以陪交付的诊断和管理。然而，这些方法可以显着贡献，对更好地了解人类遗传疾病的景观。我们预计，这些模型不仅可以作为一个FOUNdation改善临床遗传信息的解释，但也将被作为有用的模型进行治疗屏幕在体内的数据可能也被比较到硅片计算预测从如PolyPhen 23来源，SIFT 24，单核苷酸多态性与GO 25，或MutPred 26表现出一致性。需要注意的是，在先前的研究中，预测数据库的单核苷酸多态性＆GO和MutPred的被认为是最准确的，精度达到0.82和0.81，分别27 尽管我们已经简要介绍了这些方法的鲁棒性小儿解剖缺陷（ 表2，图3）的一个子集，通过这些方法，某些表型不听话。尽管有些例外，主要有三个类的疾病不适合我们的通讯协议。成人发病的疾病（如帕金森氏症）是指胚胎系统模型，是一个挑战。慢PROG退行性ression的表型（如额颞叶痴呆），可能需要更多的时间比MO活动产生的表型的7个单丝旦窗口。其他的基因敲除技术，例如RNA干扰的siRNA可干扰或降解的靶标基因，但它已经表明，没有具体的，稳定的，无毒的，或长期持久的MO 28，从而也限制了时间范围表型。第三，一些脊椎动物的结构，如哺乳动物肺，不具备足够的斑马鱼胚胎中的直向同源结构。我们还提供了建议的应急计划，以调查这些案件中，WT人类基因注射导致的表型，但我们提醒这是一个不寻常的和不良的情况。 某些疾病表型可能需要更大程度的抽象和代孕。这是可能的基因的功能已充分发散减弱模型的表型之​​间的相似性和trUE的表型，或斑马鱼生理固有的复杂性引起的疾病的效果。在这种情况下，我们建议进一步解剖解雇前的生产型。我们已经产生了一些成功的例子，其中有问题的表型这个实验已在斑马鱼胚胎模型。例如，突变TCF8，相关的基因用Fuchs的角膜营养不良（FCD），分别测定使用我们的协议，通过使用原肠胚缺陷作为一个替代的表型的基础上读出该转录本在早期发展中已知的角色29在其他情况下，例如成人发病型肌营养不良症的突变引起的DNAJB6，我们能够产生肌纤维表型在5dpf胚胎尽管事实上，人类是他们的第一个三，四十年的生活失去了明显的肌肉病理19 在这里提出的的瞬时突变体模型中，其他人也采取了优势的GE这个短暂的系统来模拟人类疾病的各种身体系统。在一个实施例中，视网膜色素变性建模在斑马鱼RP2基因的敲除，导致视网膜细胞死亡和减少视网膜层叠。救援与人野生型的mRNA的发展，导致视网膜层压所有三个层，而四的5个突变体的mRNA没有抢救30尽管这种模式的一个人的感觉障碍的形态表型的基础上，也有可能检测响应声惊吓或脉冲抑制刺激如47 近日，斑马鱼模型被用来研究阿尔茨海默病的发病机制，通过淀粉样前体蛋白31研究人员发现，基因敲除引起轴突生长受损运动神经元，这可能与人类的基因被救出。这种模式已经被证明是特别翔实，小鼠模型显示只有细微的phenotYPES（单击倒）或产后杀伤力（双击倒）。评估在体内的斑马鱼胚胎的能力，在整个开发过程帮助辨别降低的淀粉样前体蛋白（APP），以及提供了直接证据，该蛋白既需要一个正常功能的细胞外和细胞内结构域的致病效果。其他著名的车型包括额外的肌营养不良症32，钻石Blackfan贫血症33，AXENFELD里格综合征（眼和颅面部发育）34，炎症性肠病35（抗菌活性），帕金森病36（神经元和运动损失），并扣押37 （脑积水和多动症）。 更常见的是已被证明也复述人类疾病表型突变的斑马鱼线。 1,38，型号包括白血病，黑色素瘤，扩张性心肌病，杜氏肌营养不良症，和其他许多人。

功能解释遗传信息和基因的基因型预测的临床应用价值的分配是一个重大的问题，在医学遗传学，并日益尖锐的全基因组测序的加速技术和经济可行性。因此，有必要制定和实施新的范例测试意义不明的变体（VUS）检测患者的致病性。这些检测必须是​​准确的，时间和成本效率，和海港的潜在催化过渡到临床实用。 当鼠标历来在该领域的首选工具的人类疾病模型，斑马鱼是新兴科学和经济有利的替代品。斑马鱼的生物学与鼠标，可以方便及时地获取所有发育阶段，借助于光学清晰度的胚胎，它允许实时成像发展中的病症。 <sup&gt; 1突变的斑马鱼线比较近的一代提供了额外的测试和建模选项，雇用了许多功能的研究，但这项技术仍然有限（1,38审查）。不仅是敲插件费力达到的特定的突变的遗传突变体，它们也适合于中等或高通量分析的范围内，在一个单一的基因突变的测试。重要的是，可以提供一个单一的测试套件不仅对致病潜力的等位基因的信息，而且在细胞水平上（ 如失去功能与增益的关系的函数），这是用于通知的遗传方式的关键效果的方向在家庭，尤其是小的时候的人类血统怀有有限的信息遗传传输模式。可用鼠标和斑马鱼模型的用途作进一步比较， 见表1。 我们也注意到，重的斑马鱼模型系统固有的局限性。尽管D.斑马鱼的器官系统有初步发展迅速，性成熟需要约3个月。正因为如此，产前和婴幼儿发性疾病是最适合于这种瞬时表达模式。虽然适合进行大型化合物屏幕，使用遗传突变是不可行的成千上万的非同义变异，有助于系统测试，并继续在儿科疾病中被检测到。 互补这里描述的测试利用这个实验的可追踪性，高度的同源性，保护人类和斑马鱼的蛋白质之间的功能，特别是保守的发育过程中所必需的分子。 图1列出了各种等位基因效果的试验和鉴定的策略。可以执行这两个功能丧失（LOF）和主检测。对于LOF，在实验开始与感兴趣的基因吗啉击倒，抑制和表型，可能是根据调查的临床表型相关的化验。抑制可达到通过目标MO的斑马鱼（翻译阻断剂吗啉; tbMO）的轨迹的翻译起始位点处或附近，或者通过干扰剪接通过放置一个拼接位点上的MO，通常诱导任列入一个阻挡翻译内含子或异常外显子跳跃（拼接阻塞吗啉; SBMO）的。 随后，介绍了从人类同源成绩单皑皑的mRNA和表型的量化救援测量。一旦建立后，测定在人的消息中的候选基因突变可以引入并测定他们的能力抢救的MO-诱导的表型在同一作为WT​​人类mRNA的效率。相反，对于候选优势等位基因，人类基因（但不是MO）是引入与，WT人类基因不会严重影响斑马鱼的解剖学和生理学，而引进测试突变，有一个主导的作用将类似于在人体临床条件下观察到的表型诱导的期望。这个实验可以是细粒度的进一步解剖是否发生的显着效果由增益函数（GOF）或显性负性的野生型和突变型人mRNA的混合机制; GOF事件，除了野生型人类mRNA的预期为不相关的，而显性负等位基因的野生型和突变型mRNA的混合应该改变的表型诱导的突变体消息的严重程度。在所有情况下，我们建议注射的所有组合（MO吗啉代的WT人类基因与突变的人类基因等，最好是在同一个离合器的胚胎（ 见图1）。释义如下： 对于LOF试验： <ul><li>如果击倒产生的表型突变体和野生型的表达可以等价获救，等位基因可能是良性的。 </li><li>如果抢救击倒型的突变从击倒表型本身没有什么区别，等位基因可能是一个功能性的空。实验无法区分真正的空值（无功能的蛋白质）和超低的蛋白质的活性水平，没有救援能力。 </li><li>如果击倒表型突变救援显优于MO，但比野生差，等位基因可能是一个hypomorph这一结果表明部分功能丧失。 </li></ul> 对于显性的测试： <ul><li>如果没有击倒型，但注射WT基因产生的表型，必须使用一个应急计划，如果实验继续进行（见下文）。 </li><li>如果没有拦截表型和野生型的mRNA注射不产生表型，像往常一样进行实验。 </li><li>如果注射突变的mRNA是相当于野生型的mRNA的等位基因可能是良性或丧失功能，或可能已发生故障的检测。这需要进一步的实验来区分这些选项。 </li><li>如果突变的mRNA注射的基因产物的功能区分MO拦截，有可能以某种方式改变。为了区分在功能上的变化，应进行的突变体与野生型的mRNA的mRNA的滴定。 </li><li>如果滴定的结果是无法区分野生型的mRNA的单独的，它已被证明，该突变体蛋白产品使用的野生型蛋白作为底物，其效果是不同的量滴定。这表明一个显性阴性表型。 </li><li>如果滴定的结果是无法区分的单突变的mRNA，它已被显示，该突变体的蛋白质产物不再具有与野生型相同的功能，并因而是不会受到量的野生型蛋白质产物预发送。这表明，等位基因是可能的增益功能。 </li></ul> 应急预案： <ul><li>如果没有表型呈现从MO击倒，但不存在与野生型基因，进一步的实验可以发生，但我们强调的是，这种情况是不理想。 WT人类mRNA的滴定，以尽量减少表型，也可以用来作为一个新的设定点。进一步共注射野生型和突变型人mRNA的可评估的基础上的救援能力的突变。 </li></ul>

<table border="1" fo:keep-together.within-page="always">
		<tbody>
		 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Reagent</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td>
			<td>NEB</td>
			<td>M0530S, M0530L </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DpnI restriction endonuclease</td>
			<td>NEB</td>
			<td>R0176L, R0176S </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Max Efficiency DH5&alpha; competent cells</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>18258-012 </td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Big Dye Terminator</td>
			<td>Applied Biosystems</td>
			<td>4337455</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>mMESSAGE mMACHINE Kit </td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>AM1340, AM1344, AM1348</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Morpholino</td>
			<td>Gene-Tools</td>
			<td>n/a</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >1-phenyl-2-thiourea (PTU) </td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P7629</td>
			<td>Prepare as 0.003% PTU in embryo media </td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>P6148 </td>
			<td>For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4%</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td >Tricaine methane sulfonate</td>
			<td>Western Chemical</td>
			<td>N/A </td>
			<td>For anesthetization and euthanasia </td>
		 </tr>
 <tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Equipment</td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>PTC-225 Tetrad Thermal Cycler</td>
			<td>BioRad</td>
			<td>Any equivalent thermal cycler</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Nano Drop 2000 spectrophotometer</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>SMZ 745T Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>AZ100 Stereomicroscope</td>
			<td>Nikon</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DS Fi1 Digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>For color/fluorescent imaging</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>DS QiMC Digital Camera</td>
			<td>Nikon</td>
			<td>For black/white imaging</td>
			<td></td>
		 </tr>
		 <tr>
			<td>Advanced Resarch 3.2 Imaging Software</td>
			<td>NIS- Elements</td>
			<td></td>
			<td></td>
		 </tr>
		</tbody>
 </table>

in vivo modeling of the morbid human genome using danio rerio

在这里，我们介绍的方法分析查询使用在斑马鱼体内互补的潜在临床意义的同义变化的发展。斑马鱼 （Danio rerio）是有用的动物系统中，由于他们的实验的易处理性，胚胎是透明的，使轻便观看，经过快速发展体外，可以操纵基因。1。在这些方面的允许分析胚胎发育的显着的进步，分子过程，和骨形态发生信号。脊椎动物模型的优点，这两者合计，使斑马鱼的高度适合建模儿科疾病的发育缺陷，和在某些情况下，成人发病的疾病。因为斑马鱼的基因组与人类（〜70％的同源）是高度保守的，它是可以概括在斑马鱼的人类疾病状态。这是通过或者通过注射突变型人米RNA诱导功能等位基因显性负或收益，或利用吗啉（MO）的反义寡核苷酸抑制基因模仿丧失功能的变种。通过MO-诱导皑皑的人类基因表型的互补，我们的方法能够解释的基础上的人类蛋白质序列突变基因的能力拯救一个可衡量的，有关生理表型突变的有害影响。人类疾病的等位基因建模通过注射MO和/或在1-4细胞阶段的人类基因，7天受精后（DPF）和表型的斑马鱼胚胎发生。这是一般的策略可以扩展到很宽范围的疾病表型，这表现在下面的协议。我们提出我们建立的模型形态信号，颅面，心脏，血管的完整性，肾功能，骨骼肌肉疾病的表型，以及其他。

隐性和Pseudorecessive失调初级纤毛近乎无处不在的结构在脊椎动物体内计划，发挥细胞信号传导的角色，在多种细胞的命运，包括增殖，极性，分化和组织维护这些细胞器的功能障碍导致了广泛的人类遗传性疾病统称为称为ciliopathies 6,7这样一个临床实体Bardet Biedl综合征（BBS），多系统的儿科疾病，视网膜变性，肥胖，性腺功能低下，多指（趾），肾功能不全特征。 在体内检测致病等位基因的发展是必要的论坛因为）它是一种遗传异质性疾病引起的主要是私人的同义变化发生在至少17个基因7-10;和b）寡继承&gt; BBS家庭的25％，其中杂合子的变化在第二论坛除了隐性主要的致病突变基因（）可以调节临床外显率和表现。通常情况下，这样的第三等位基因杂合子的同义变化，从遗传学的角度来看，还不清楚致病潜力，因此需要准确的解释，他们对蛋白质功能的生物效应。11-13 探讨潜在的致病突变论坛突变负荷做出贡献，我们初步确定BBS1 - BBS14测试了所有的错义变化。我们和其他人已经表明，基体蛋白损失产生失调的平面细胞极性（PCP非经典Wnt信号）表现为收敛扩展的缺陷，在斑马鱼胚胎中体节14使用此有关生理表型读出，已经发现，抑制BBS基因体轴缩短，更广泛和更薄的体节，而宽，扭结notochords的15 &lt;/线上（图2）引起的MO抑制产生的原肠胚形成的缺陷，和共注射与人类mRNA的显着获救（再现性）这些表型的得分由三种不同的体内方法。首先，胚胎被现场拿下根据定性的表型标准（正常，I类和II类的表型类的详细定义见15）。接下来，我们在外包过程中定量细胞迁移（早期发育阶段的特点是在卵黄细胞16）通过采用荧光示踪可视化迁移细胞的细胞层变薄和传播。最后，我们测量体节的躯干长度在9体节胚胎原位杂交的鸡尾酒krox20，PAX2和myoD的的的核糖探针，持平安装形态分析。 这种方法已经被用来测试500等位基因在睫状肌突变空间超出。在一个体内检测&gt; 130等位基因独自学习，产生了一系列的表型的分数，我们的协议表示（图1）完成救援被列为良性（不显着不同的从WT救援），部分抢救被列为hypomorphs的（显着改善来自密苏里州，但更严重的比WT救援），故障救援功能空（没有显着不同MO）和表型诱导突变基因被列为主导底片相比，MO被列为。 我们也评估，灵敏度和特异性的斑马鱼体内互补实验。特异性证实了合作注入常见SNPs（&gt; 5％的次要等位基因频率在健康对照人群），这些被发现给予良性的表型，在14/17测试（&gt; 82％），和敏感性被证明是98％ 体内数据和遗传参数足以吨之间的一致性O属性等位基因作为在一个BBS血统因果。17此外，使用三个体内措施（外包跟踪，现场打分，ISH形态测量） 在体外用免疫印迹和细胞定位研究验证观察到的表型效应。虽然解释这些结果前需要了解至少一种疾病的发病机制，这个例子中提供的证据，以证明我们的协议的实用性和鲁棒性。以来，我们已经证实了我们的在体内得分与多个其他线路在一个公正的突变筛查和功能实验证据分析研究TTC21B的 ，逆行intraflagellar的转运蛋白。 主导疾病肢带型肌营养不良症（LGMD）类肌营养不良症是一种常染色体显性遗传，造成缓慢前进中在臀部和肩膀的肌肉无力。我和这个基因chanistically组异质性疾病所造成的显性和隐性突变跨越多个细胞膜，肌节，细胞质和细胞核蛋白。基于磁共振成像肌受累的临床表型和证据的呈现，我们调查的主导的原因在芬兰，美国和意大利的家庭19 LGMD发现。在映射的轨迹位置的候选人测序揭示突变在DNAJB6，至少两个剪接异构体（细胞核和细胞质）在人类基因编码的共同分子伴侣HSP70家族表示。要获得DNAJB6功能和其相关LGMD的进一步深入了解，我们在斑马鱼研究其作用在肌肉的完整性。的斑马鱼（dnajb6b）直向同源物的RT-PCR方法检测到表达为早五体节阶段，然后通过注射的胚胎与拼接阻塞的吗啉代。在受精后48小时，蒙面的得分表明支队慢纤维插入点。这种表型的特异性进行测试的第二非重叠MO，并随后与野生型人类DNAJB6 mRNA的救出。 要查询如何损失DNAJB6功能导致肌肉的完整性的缺陷，我们介绍了发现的错义突变的患者为人类转录两种异构体，并将其注射到斑马鱼的胚胎。虽然注射WT人类mRNA的产生没有明显的表型，这些变化phenocopied工程时，在细胞质中的MO的作用效果的损失，但不是核的异构体。其次是共注射等摩尔量的突变体和野生型的mRNA，这表明增强肌肉表型的严重程度，提出了显性效应。为了测试这个概念，改变突变体和野生型基因的摩尔比进行了进一步的注射。与预测相一致，较WT诱导胚胎致死突变的mRNA的过量，而Ñ​​过量生产的WT逐步增加救援。在这之后， 在体外实验中，确定oligimerization性能和可能的蛋白质的相互作用。这些表明，突变损害细胞质DNAJB6的抗凝集活性和干扰的突变型和野生营业额，以及与另一个的分子，BAG3，这也是相关的病理机制的LGMD，由于LOF BAG3导致的儿科形式肌营养不良症20。我们然后问是否BAG3可以调节表型诱导斑马鱼突变DNAJB6b的的。 ，虽然注射WT BAG3独自制作没有表型，共注射与DNAJB6突变体显着增加的表型的严重程度，这是BAG3这些突变体19介导的致病性中起重要作用。 <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 瞬态斑马鱼模型 </td> &lt;TD&gt; 突变斑马鱼线 </td><td> 转基因小鼠线 </td></tr><tr><td> 人类表型的发病年龄正在调查 </td><td><ul><li>产前</li><li>新生儿</li><li>小儿科的</li></ul></td><td><ul><li>产前</li><li>新生儿</li><li>小儿科的</li></ul></td><td><ul><li>产前</li><li>新生儿</li><li>小儿科的</li><li>成人</li></ul></td></tr><tr><td> 可行的表型 </td><td><ul><li>颅面</li><li>肌肉发达</li><li>发信号</li><li>心脏的</li><li>肾</li><li>血管</li></ul></td><td><ul><li>颅面</li><li>肌肉发达</li><li>发信号</li><li>心脏的</li><li>肾</li><li>血管</li></ul></td><td><ul><li>颅面</li><li>肌肉发达</li><li>发信号</li><li>心脏的</li><li>肾</li><li>血管</li><li>感觉的</li><li>骨骼</li><li>内脏</li><li>行为</li><li>呼吸</li><li>生殖</li><li>内分泌</li><li>代谢</li></ul></td></tr><tr><td> 直到使用时间 （从出生） </td><td> 1-7天</td><td> &gt; 3个月</td><td> &gt; 6个月</td></tr><tr><td> 吞吐量 </td><td>中高</td><td>低</td><td>低</td></tr><tr><td> 优点 </td><td><ul><li>测试特定突变的能力</li><li>能够产生连锁反应的型号</li><li>能够使用吗啉击倒</li><li>低维护成本</li></ul></td><td><ul><li>减的实验变异</li></ul></td><td><ul><li>关于建立更紧密进化关系</li><li>器官结构的保护</li><li>基因的能力率敲在模型</li></ul></td></tr></tbody></table> 表1中。 体内模型中的比较 。 <img alt="表2" src="/files/ftp_upload/50338/50338table2.jpg" fo:content-width="7in" fo:src="/files/ftp_upload/50338/50338table2highres.jpg"/> 表2中。下测试所提出的协议的实施例中体内人类dysmorphologies建模。各种表型。可采用一系列的表型的读数和可视化技术的基于无序的类型。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50338/50338table2highres.jpg" target="_blank">点击这里查看更大的表。</a> <img alt="图1" src="/files/ftp_upload/50338/50338fig1.jpg" /> 如图1所示。 在体内功能测试同义变种。所有功能测试系统的方法ELES模型未知或假设的意义。其次是由一系列的（共）注射野生型和突变型人mRNA的基因敲除通过吗啉代显微注射。统计分析表型的结果告知等位基因致病性和分子功能。简言之， 丧失功能测试：如果击倒产生突变体和野生型表达的表型可以等价获救的等位基因可能是良性的（绿盒）。如果击倒表型突变救援击倒表型没有区别，等位基因可能是一个功能性空（黄色框）。如果拦截表型的突变拯救比MO的显着水平，但比野生差，等位基因可能是一个hypomorph（绿色方块）。 对于显性的测试：如果突变的mRNA注射相当于野生型的mRNA的等位基因可能是良性或丧失功能，或可能已经失败的实验（绿盒）。如果突变的mRNA注射因迪斯<html>区别开从MO拦截，基因产物的功能，有可能以某种方式改变。为了区分在功能上的变化，滴定突变体与野生型的mRNA的mRNA。如果该滴定的结果是无法区分野生型的mRNA的单独突变蛋白产品使用的野生型蛋白作为底物，从而指示一个显性阴性表型（蓝色框）。如果滴定的结果是无法区分的单突变的mRNA，突变蛋白质产物不再具有与野生型的功能相同，因此，很可能的增益函数（蓝色框）。如果没有表型呈现从MO拦截，但不与野生型的mRNA的存在，可能会出现进一步的实验，WT人类mRNA的滴定，以尽量减少表型，也可以用来作为一个新的设定点。野生型和突变型人mRNA的进一步的共注射可以评价根据抢救能力的突变体（粉红色框）。ET =“_blank”&gt;点击这里查看大图。 <img alt="图2" src="/files/ftp_upload/50338/50338fig2.jpg" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50338/50338fig2highres.jpg"/> 图2。定量和定性的评价MKS1突变检测在人类中MKS1 morphant的胚胎发育缺陷。根据严重性分为三组，表型。每个类的实例所示（a）中 ，普遍存在于胚胎世代组（n = 100-160胚胎）的表列（图中未示出）。 MO注射胚胎I类表型正常形态，但有严重较短，蛋黄相比过多的胚胎组织来控制注射的胚胎在相同的体节年龄（8-9体节）。被II类与colo2a1的变薄，短而不发达的头部和尾部结构，另外缺乏体节的定义和对称性。 III类胚胎体节发育不良和畸形的严重延误，起伏notochords，通常没有生存过去的10体节阶段。共注射的人类MKS1 mRNA的救出这些缺陷，MKS1抑制证明特异性表型。胚胎在11体节阶段（±1体节）染色，krox20，PAX2和myoD的核糖探针原位杂交（乙，丙）。表型进行定量测量从第一个到最后一个明显的体节的每个胚胎（箭头）， 在 c定量。图改编许可15。 <img alt="图3" src="/files/ftp_upload/50338/50338fig3.jpg" fo:content-width="3.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50338/50338fig3highres.jpg"/> 图3。人类畸形学的体内模型中的例子。 （一）颅面畸形学。控制基因注射胚胎（左）和突变体注射胚胎（右）在5 DPF阿尔辛蓝染色。突变的mRNA注入胚胎显示特别是小，畸形头张开鳃弓和缺失或异常结构包括颅面骨软骨与一般的混乱。（二）微/大头畸形。控制未注射胚胎（左）和kctd13 MO注射胚胎（右）在5 DPF。与colo2a1显示加宽的头部，所看到的眼睛之间的空间21（c）减少血管的完整性。控制未注射胚胎（顶部）和2 DPF在FLI1用荧光显微镜成像英 MO注射胚胎（底部）：绿色荧光蛋白转基因记者线。与colo2a1显示减值发芽间血管和其他血管结构。41（D）单向原位杂交心脏循环改变。野生型胚胎njected（左）显示SPAW表达在左外侧板中胚层，而ccdc39 morphant胚胎表现为双侧（右），在大多数情况下，检测不到的SPAW表达（未显示），43（E）肾囊肿。未注射WT胚胎（顶部）和ift80 morphant的（底部）。的显示与colo2a1大的肾囊肿（箭头），心包水肿（箭头）和卷曲的尾巴。44（F）肾小球滤过减少。荧光可视化控制注射胚胎（顶部）和罗丹明右旋糖酐注射到心脏后ift80 morphant的（底部）24小时。荧光分散在整个血管系统和几乎完全抽空肾脏观察荧光，完全没有控制。 morphant的显示持久的荧光右旋糖酐，提示肾小球滤过减少46（克）肌肉萎缩症。 WT DNAJB6先生NA注射胚胎（顶部）显示正常的慢肌纤维跨越体节通常相邻myosepta之间的如使用防慢肌球蛋白抗体免疫组化确定。突变DNAJBb（底部）显示在一个或多个个体节，局部完成支队从myosepta肌纤维，19（H）体节角。放大控制注射的（顶部）或底部）kif7的与colo2a1（30高倍视野成像的现场侧面的景致。的显示与colo2a1异常形状的体节，占异位刺猬信号在斑马鱼的肌节47 经许可后改编的所有数字。

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In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

在这里，我们提出了一个系统的方法来开发有关生理，敏感，特异<em&gt;在体内</em&gt;分析用于解释人类病理学变化。瞬态的遗传操作，通过微量注射野生型和突变型人mRNA和吗啉代（MO）的反义寡核苷酸利用显影斑马鱼胚胎的快速检测致病突变，特别是，但不完全是，在人类发育障碍的上下文中的易处理性。

在体内病态的人类基因组建模使用斑马鱼

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

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Research

JoVE Journal

Biology

In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

20.5K 次观看.  Duke University Medical Center. 在这里，我们提出了一个系统的方法来开发有关生理，敏感，特异在体内分析用于解释人类病理学变化。瞬态的遗传操作，通过微量注射野生型和突变型人mRNA和吗啉代（MO）的反义寡核苷酸利用显影斑马鱼胚胎的快速检测致病突变，特别是，但不完全是，在人类发育障碍的上下文中的易处理性。

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Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish (Danio rerio)

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the cellular and molecular features of the epithelia, which are mainly composed of two types of cells: hair cells (HCs) and supporting cells (SCs). Here we choose to study the inner ear sensory epithelia in adult zebrafish not only because the epithelial structures are highly conserved in all vertebrates studied, but also because the adult zebrafish is able to regenerate HCs, an ability that mammals lose shortly after birth. We use the inner ear of adult zebrafish as a model system to study the mechanisms of inner ear HC regeneration in adult vertebrates that could be helpful for clinical therapy of hearing/balance deficits in human as a result of HC loss.
Here we demonstrate how to do gross and fine dissections of inner ear sensory epithelia in adult zebrafish. The gross dissection removes the tissues surrounding the inner ear and is helpful for preparing tissue sections, which allows us to examine the detailed structure of the sensory epithelia. The fine dissection cleans up the non-sensory-epithelial tissues of each individual epithelium and enables us to examine the heterogeneity of the whole epithelium easily in whole-mount epithelial samples.

Gross and Fine Dissection of Inner Ear Sensory Epithelia in Adult Zebrafish Danio rerio

The inner ear sensory epithelium of adult zebrafish is a good model system for understanding the mechanisms of hair cell regeneration in adult vertebrates. This protocol demonstrates the fine dissection of the epithelia, through which we can get tissue samples for studying the regenerative events at cellular and subcellular levels.

格罗斯和精细解剖内耳感觉上皮细胞在成年斑马鱼（斑马鱼）

Neurosensory epithelia in the inner ear are the crucial structures for hearing and balance functions. Therefore, it is important to understand the ...

科研

生物学

Flow Cytometry Purification of Mouse Meiotic Cells

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the unique differentiation programs that are manifest during meiosis. Two principal methods have been developed to purify, to varying degrees, various meiotic fractions from both adult and immature animals: elutriation or Staput (sedimentation) using BSA and/or percoll gradients. Both of these methods rely on cell size and density to separate meiotic cells1-5. Overall, except for few cell populations6, these protocols fail to yield sufficient purity of the numerous meiotic cell populations that are necessary for detailed molecular analyses. Moreover, with such methods usually one type of meiotic cells can be purified at a given time, which adds an extra level of complexity regarding the reproducibility and homogeneity when comparing meiotic cell samples.
Here, we describe a refined method that allows one to easily visualize, identify, and purify meiotic cells, from germ cells to round spermatids, using FACS combined with Hoechst 33342 staining7,8. This method provides an overall snapshot of the entire meiotic process and allows one to highly purify viable cells from most stage of meiosis. These purified cells can then be analyzed in detail for molecular changes that accompany progression through meiosis, for example changes in gene expression9,10and the dynamics of nucleosome occupancy at hotspots of meiotic recombination11.

An efficient method to obtain highly purified viable meiotic fractions from mouse testis is described, which combines a refined cell dissociation protocol with fluorescent activated cell sorting (FACS). This method takes advantage of differences in the DNA content and nuclear density of discrete meiotic fractions.

流动小鼠减数分裂细胞的流式细胞仪净化

The heterogeneous nature of cell types in the testis and the absence of meiotic cell culture models have been significant hurdles to the study of the ...

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work examining post-embryonic through adult cardiac development has been limited7-10. Examining the changing morphology of the maturing and aging heart are restricted by the lack of techniques available for staging and isolating juvenile and adult hearts. In order to analyze heart development over the fish's lifespan, we dissect zebrafish hearts at numerous stages and photograph them for further analysis11. The morphological features of the heart can easily be quantified and individual hearts can be further analyzed by a host of standard methods. Zebrafish grow at variable rates and maturation correlates better with fish size than age, thus, post-fixation, we photograph and measure fish length as a gauge of fish maturation. This protocol explains two distinct, size dependent dissection techniques for zebrafish, ranging from larvae 3.5mm standard length (SL) with hearts of 100&mu;m ventricle length (VL), to adults, with SL of 30mm and VL 1mm or larger. Larval and adult fish have quite distinct body and organ morphology. Larvae are not only significantly smaller, they have less pigment and each organ is visually very difficult to identify. For this reason, we use distinct dissection techniques.
We used pre-dissection fixation procedures, as we discovered that hearts dissected directly after euthanization have a more variable morphology, with very loose and balloon like atria compared with hearts removed following fixation. The fish fixed prior to dissection, retain in vivo morphology and chamber position (data not shown). In addition, for demonstration purposes, we take advantage of the heart (myocardial) specific GFP transgenic Tg(myl7:GFP)twu34 (12), which allows us to visualize the entire heart and is particularly useful at early stages in development when the cardiac morphology is less distinct from surrounding tissues. Dissection of the heart makes further analysis of the cell and molecular biology underlying heart development and maturation using in situ hybridization, immunohistochemistry, RNA extraction or other analytical methods easier in post-embryonic zebrafish. This protocol will provide a valuable technique for the study of cardiac development maturation and aging.

Heart Dissection in Larval, Juvenile and Adult Zebrafish, Danio rerio

A clear, standardized method for dissection and isolation of the zebrafish heart at multiple developmental stages are described. Annotation and quantification techniques are also discussed.

幼虫，少年和成年斑马鱼的心脏解剖，斑马鱼</em

Zebrafish have become a beneficial and practical model organism for the study of embryonic heart development (see recent reviews1-6), however, work ...

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish (Danio rerio) Laboratory: An Introduction

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and behavioural research. As a vertebrate, zebrafish share considerable genetic sequence similarity with humans and are being used as an animal model for various human disease conditions. The advantages of zebrafish in comparison to other common vertebrate models include high fecundity, low maintenance cost, transparent embryos, and rapid development. Due to the spur of interest in zebrafish research, the need to establish and maintain a productive zebrafish housing facility is also increasing. Although literature is available for the maintenance of a zebrafish laboratory, a concise video protocol is lacking. This video illustrates the protocol for regular housing, feeding, breeding and raising of zebrafish larvae. This process will help researchers to understand the natural behaviour and optimal conditions of zebrafish husbandry and hence troubleshoot experimental issues that originate from the fish husbandry conditions. This protocol will be of immense help to researchers planning to establish a zebrafish laboratory, and also to graduate students who are intending to use zebrafish as an animal model.

Regular Care and Maintenance of a Zebrafish Danio rerio Laboratory: An Introduction

This protocol outlines regular maintenance and care to maintain optimal conditions for zebrafish husbandry. The video illustrates the protocol for system maintenance, regular housing, feeding, breeding, and raising of zebrafish larvae.

定期保养和维护的斑马鱼（<em&gt;斑马鱼</em&gt;）实验室简介

This protocol describes regular care and maintenance of a zebrafish laboratory. Zebrafish are now gaining popularity in genetics, pharmacological and ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

高通量<em&gt;斑马鱼</em&gt;能量消耗分析

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC (Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin)

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to dose-limiting toxicity and many adverse side effects. Targeting the genome with sequence-specific small molecules may enable molecules with increased therapeutic index and fewer off-target effects. N-methylpyrrole/N-methylimidazole polyamides are molecules that can be rationally designed to target specific DNA sequences with exquisite precision. And unlike most natural transcription factors, polyamides can bind to methylated and chromatinized DNA without a loss in affinity. The sequence specificity of polyamides has been extensively studied in vitro with cognate site identification (CSI) and with traditional biochemical and biophysical approaches, but the study of polyamide binding to genomic targets in cells remains elusive. Here we report a method, the crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC), that identifies polyamide binding sites across the genome. COSMIC is similar to chromatin immunoprecipitation (ChIP), but differs in two important ways: (1) a photocrosslinker is employed to enable selective, temporally-controlled capture of polyamide binding events, and (2) the biotin affinity handle is used to purify polyamide&#8211;DNA conjugates under semi-denaturing conditions to decrease DNA that is non-covalently bound. COSMIC is a general strategy that can be used to reveal the genome-wide binding events of polyamides and other genome-targeting chemotherapeutic agents.

Genome-wide Mapping of Drug-DNA Interactions in Cells with COSMIC Crosslinking of Small Molecules to Isolate Chromatin

Identifying the direct targets of genome-targeting molecules remains a major challenge. To understand how DNA-binding molecules engage the genome, we developed a method that relies on crosslinking of small molecules to isolate chromatin (COSMIC).

药物与DNA相互作用的细胞全基因组映射与COSMIC（小分子交联，染色质隔离）

The genome is the target of some of the most effective chemotherapeutics, but most of these drugs lack DNA sequence specificity, which leads to ...

Gap Junctional Intercellular Communication: A Functional Biomarker to Assess Adverse Effects of Toxicants and Toxins, and Health Benefits of Natural Products

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction channels, which is a major intercellular process by which tissue homeostasis is maintained. Interruption of gap junctional intercellular communication (GJIC) by toxicants, toxins, drugs, etc. has been linked to numerous adverse health effects. Many genetic-based human diseases have been linked to mutations in gap junction genes. The SL-DT technique is a simple functional assay for the simultaneous assessment of GJIC in a large population of cells. The assay involves pre-loading cells with a fluorescent dye by briefly perturbing the cell membrane with a scalpel blade through a population of cells. The fluorescent dye is then allowed to traverse through gap junction channels to neighboring cells for a designated time. The assay is then terminated by the addition of formalin to the cells. The spread of the fluorescent dye through a population of cells is assessed with an epifluorescence microscope and the images are analyzed with any number of morphometric software packages that are available, including free software packages found on the public domain. This assay has also been adapted for in vivo studies using tissue slices from various organs from treated animals. Overall, the SL-DT assay can serve a broad range of in vitro pharmacological and toxicological needs, and can be potentially adapted for high throughput set-up systems with automated fluorescence microscopy imaging and analysis to elucidate more samples in a shorter time.

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer technique that measures intercellular communication through gap junction channels. Gap junctional intercellular communication is a major cellular process by which tissue homeostasis is maintained and disruption of this cell signaling has adverse health effects.

间隙连接通讯：天然产物的生物标志物的功能，以评估毒物和毒素的不利影响，以及健康的益处

This protocol describes a scalpel loading-fluorescent dye transfer (SL-DT) technique that measures intercellular communication through gap junction ...

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell proliferation, migration, and alignment to form tubular structures followed by recruitment of pericytes to provide mural support and facilitate vessel maturation. Current in vitro cell culture approaches cannot fully reproduce the complex biological environment where endothelial cells and pericytes interact to produce functional vessels. We present a novel application of the in vivo matrix gel plug assay to study endothelial-pericyte interactions and formation of functional blood vessels using severe combined immune deficiency mutation (SCID) mice. Briefly, matrix gel is mixed with a solution containing endothelial cells with or without pericytes followed by injection into the back of anesthetized SCID mice. After 14 days, the matrix gel plugs are removed, fixed and sectioned for histological analysis. The length, number, size and extent of pericyte coverage of mature vessels (defined by the presence of red blood cells in the lumen) can be quantified and compared between experimental groups using commercial statistical platforms. Beyond its use as an angiogenesis assay, this matrix gel plug assay can be used to conduct genetic studies and as a platform for drug discovery. In conclusion, this protocol will allow researchers to complement available in vitro assays for the study of endothelial-pericyte interactions and their relevance to either systemic or pulmonary angiogenesis.

In Vivo Study of Human Endothelial-Pericyte Interaction Using the Matrix Gel Plug Assay in Mouse

We present a protocol to study human endothelial-pericyte interactions in mouse using a variation of the matrix gel plug angiogenesis assay.

在人类内皮周细胞的相互作用使用基质凝胶插件检测小鼠的体内研究

Angiogenesis is the process by which new blood vessels are formed from existing vessels. New vessel growth requires coordinated endothelial cell ...

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a versatile analytical tool for characterizing viscoelastic mechanical properties for a variety of materials ranging from hard (plastic, glass, metal, etc.) surfaces to cells on any substrate. It has been widely used to measure the stiffness of cells, but less frequently used to measure the stiffness of aortas. In this paper, we will describe the procedures for using AFM in contact mode to measure the ex vivo elastic modulus of unloaded mouse arteries. We describe our procedure for isolation of mouse aortas, and then provide detailed information for the AFM analysis. This includes step-by-step instructions for alignment of the laser beam, calibration of the spring constant and deflection sensitivity of the AFM probe, and acquisition of force curves. We also provide a detailed protocol for data analysis of the force curves.

Measuring the Stiffness of Ex Vivo Mouse Aortas Using Atomic Force Microscopy

We present detailed protocols for isolation of aortas from mouse and measurement of their elastic modulus using atomic force microscopy.

测量的刚度<em&gt;离体</em&gt;鼠标主动脉用原子力显微镜

Arterial stiffening is a significant risk factor and biomarker for cardiovascular disease and a hallmark of aging. Atomic force microscopy (AFM) is a ...

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

The intestinal barrier defends against pathogenic microorganism and microbial toxin. Its function is regulated by tight junction permeability and epithelial cell integrity, and disruption of the intestinal barrier function contributes to progression of gastrointestinal and systemic disease. Two simple methods are described here to measure the permeability of intestinal epithelium. In vitro, Caco-2BBe cells are plated in tissue culture wells as a monolayer and transepithelial electrical resistance (TER) can be measured by an epithelial (volt/ohm) meter. This method is convincing because of its user-friendly operation and repeatability. In vivo, mice are gavaged with 4 kDa fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran, and the FITC-dextran concentrations are measured in collected serum samples from mice to determine the epithelial permeability. Oral gavage provides an accurate dose, and therefore is the preferred method to measure the intestinal permeability in vivo. Taken together, these two methods can measure the permeability of the intestinal epithelium in vitro and in vivo, and hence be used to study the connection between diseases and barrier function.

In Vitro and In Vivo Approaches to Determine Intestinal Epithelial Cell Permeability

Two methods are presented here to determine intestinal barrier function. An epithelial meter (volt/ohm) is used for measurements of transepithelial electrical resistance of cultured epithelia directly in tissue culture wells. In mice, the FITC-dextran gavage method is used to determine the intestinal permeability in vivo.