Name: in vivo modeling of the morbid human genome using danio rerio
Uploaded: 2013-08-24T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 31 s
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우리는 듀크 대학 학장의 여름 연구 원정대 (), 미국 심장 협회 (AHA) 교제 11POST7160006 (CG), 국립 보건원 (NIH)의 국립 안과 연구소 (EED), R01HD04260에서 보조금 R01-EY021872에서 지원을 인정 국가 아동 건강 개발 연구소 (NK), 당뇨병 소화기 및 신장 질환의 국립 연구소 (NK)에서 R01DK072301 및 R01DK075972, 그리고 유럽 연합 (GA NR에서 EU 제 7 회 FP의 재정 241955, 프로젝트 SYSCILIA;. EED, NK) NK는 고유 장 조지 W. Brumley 교수.

1. 생물 정보학 분석 <ol><li> 그 인간의 유전자가 zebrafish의 ortholog이 있는지 확인하고, 만약 그렇다면, 얼마나 많은 복사합​​니다. 우리는 상호 BLAST (추천 <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/</a> zebrafish의 게놈에 인간의 단백질), 그리고 인간 게놈에 대한 공격 최고의 제브라 피쉬의 후속 BLAST합니다. 사실 orthologs 각 인스턴스에서 최고의 히트 될 것입니다. </li><li> 인간 유전자의 오픈 읽기 프레임 (ORF)의 크기를 결정합니다. 6킬로바이트 이상하면,이 모델 때문에 긴 템플릿 관내 전사에서 고품질의 한계 현재 어려운 것입니다. </li><li> PCS2에서 인간의 ORF + 벡터 백본 (또는 5 &#39;SP6 전사 사이트 3&#39;polyA 신호에 해당 벡터)를 포함하는 구조를 얻거나 생성합니다. </li><li> 대상 zebrafish의 유전자 접합 또는 번역을 차단하는 MO를 디자인합니다. 여러 복사본은 제브라 피쉬 게놈, 거기에있는 경우전자 두 가지 옵션이 있습니다 : 추가 수법의 살인의) 설계, 또는 b) 완전히 사본 사이에 보존 스플 라이스 사이트의 식별은 단일 MO 효과가 될 수있는 반대. 일부 출판 MO 시퀀스에서 사용할 수 있습니다 <a href="http://www.zfin.org" target="_blank">www.zfin.org</a> . </li></ol> 2. 개발 제브라 피쉬 배아에서 발현 분석 <ol><li> 제브라 피쉬의 ortholog이 표현형 판독에 관련된 시공간적 맥락에서 표현 있는지 확인합니다. 어떤 식 데이터 관심의 유전자 사용할 수없는 경우, 전체 제브라 피쉬 배아에서 또는 현장 하이브리드 화에서 cDNA를 사용하여 (RT)-PCR 역전사를 실시합니다. (2,3 참조). </li></ol> 3. 사이트 감독 돌연변이 유발 <ol><li> 센터에서 원하는 돌연변이 길이의 디자인 돌연변이 유발 프라이머 25-45 기지. 프라이머 용융 온도보다 크거나 78 ° C. 같아야한다 반대를 단련하는 순방향 및 역방향 돌연변이 유발 프라이머를 디자인플라스미드의 가닥. </li><li> ORF 후 돌연변이의 시퀀스 확인을 위해 프라이머를 얻을, 이러한 전체 ORF를 포함 할 ~ 300 기본 쌍 섹션에 걸쳐 타일해야합니다. </li><li> 95 ° C 30 초, 2 : 95 ° C 30 초, 3 (1 다음과 같이 고성능 중합 효소와주기 돌연변이 유발 반응을 조립 55 ° C 1 분, 4 : 68 ° C 6 분, 5 : 이동 2 18X, 6 : 4 ° C, 영원히 7 최종). </li><li> 2 시간 동안 37 ° C에서 알을 품다, 댐 메틸화 템플릿을 제거하는 반응 당 1 μL DpnI 제한 효소를 추가합니다. </li><li> 표준 프로토콜에 따라 20 μL 유능한 세포에 돌연변이 유발 반응의 2 μl를 변환 할 수 있습니다. </li><li> 3-4 식민지를 선택하고 적절한 항생제를 포함하는 LB 미디어 5 mL를 접종. 225 rpm에서 37 ° C에서 밤새 흔들어. </li><li> Miniprep DNA가와 농도를 결정합니다. </li><li> 서열 변이 사이트는 관심 돌연변이의 존재를 확인합니다. </li><li> 순서의 무결성을 확인하기 위해 일련의 전체 ORF. </li></ol> 4. 체외 mRNA의 전사 <ol><li> 선형 PCS2 + 템플릿을 사용하여 mMessage mMachine SP6 키트 (Ambion)를 사용 덮인의 mRNA를 생성합니다. 우리는 반응 구성 요소 수량의 절반을 사용하는 것이 좋습니다. </li><li> 키트 지침에 설명 된대로 LiCl을 침전 또는 페놀 클로로포름과 RNA 샘플을 정화. </li><li> 흡광도를 사용하여 mRNA의 농도를 결정하고, 겔 전기 영동을 사용하여 발현의 무결성을 보장하고, 사용 전까지 -80 ° C에서 세 개 이상의 분주에서 샘플을 저장합니다. 우리는 mRNA의 분주 여러 동결 - 해동 사이클을 사용하지 않는 것이 좋습니다. </li></ol> 5. 기능의 변형 손실의 생체 분석에 <ol><li> 자연 제브라 피쉬의 교배에서 zebrafish의 배아를 취득하고, ° C 배아 물에 6 10cm 접시에 28에서 그들을 유지합니다. </li><li> 표현형 특이성, MO의 효율성과 MO 독성을 평가하기 위해 모르 선량 반응 곡선을 실시한다. 에서의 용량 곡선을 주입50-100 (1-4 세포 단계) 제브라 피쉬 배아 / 배치에 1-10 NG MO 사이에 최소 세 가지 다른 농도. 효율적인 수법의 살인은 일괄 영향을받는 배아의 비율 용량 의존적으로 증가를 야기한다. </li><li> 적절한 발달 단계에서 표현형의 배아는 관심과 관련 표현형이 관찰 될 무대의 대상 zebrafish의 유전자의 발현에 따라. 이는 (표준화 된 표현형의 기준에 따라) 정량 (예 : 해부학 적 구조 사이의 측정) 또는 질적 수 있습니다. 모든 주사&gt; 24 득점을위한 HPF : 배아는 멜라닌 세포 형성의 최대 감소 24 HPF에서 PTU (0.003 % 1 - 페닐 -2 - 티오 우레아 배아 미디어)로 치료해야합니다. </li><li> 전체 배아에서 총 RNA를 추출하여 결합 블로킹 수법의 살인 테스트 MO 효율성 표현형 점수의 시점에서 해물를 들어, cDNA를 생성하고 MO 대상 사이트를 측면에서는 프라이머를 사용하여 대상 유전자의 RT-PCR을 실시합니다. </li><li> 억제 effic을 확인하려면TB-MO, 수확 전체 배아 단백질 해물 iency 및 타겟 단백질 제어 대 수준을 비교하는 immunoblotting을 실시합니다. 제브라 피쉬의 단백질 많은 상용 항체 교차 반응 제한이 있기 때문에 그러나,이 방법은 모든 대상 유전자 의무가 없습니다. MO 특이성을 보여주는 두 가지 간접적 인 방법은 다음과 같습니다 :) 표현형에 용량 의존적으로 효과가 있다는 것을 입증하고, B) TB-MO와 야생형의 mRNA의 공동 주입 효율적으로 표현형을 구출하는 보여주는. 가능하면 효율이 직접 모니터링 할 수 있기 때문에 이러한 이유로, 우리는 결합 차단기를 추천합니다. </li><li> 표현형은 5.7 단계로 진행 관찰되는 경우에는 표현형이 관찰되지 않은 경우, 6.1 단계로 진행합니다. </li><li> 질적 형질의 경우, 배아 50-75 %에 영향을하는 MO 용량을 선택하고 양적 형질에 대해, 표현형 측정 (p &lt;0.001) 야생 형에서 크게 차이가있는 MO 용량을 선택합니다. 제브라 피쉬의 emb의 새로운 배치를 주입MO의 &#39;분석&#39;용량과 인간 WT mRNA의 (10-200 PG의 발현에 이르기까지의 용량 곡선을 포함하는 칵테일, ryos (N = 50-100/batch 1-4 세포 단계)이 복용 위의 실질적 발현을 확인 제브라 피쉬 배아에서 총 polyA mRNA의의 0.25-0.5 %를 나타내는 단일 사본의 기준) 4. </li><li> 사출 배치 마스크 점수를 실시, MO 형에 비해 가장 중요한 구조와 WT mRNA의 용량을 선택,이 mRNA를 &quot;분석&quot;복용량이다. </li><li> MO의 분석 용량과 돌연변이 인간의 mRNA 분석 복용량, 새로운 배치 (N = 50-100/batch 1-4 세포 단계)를 주입한다. 표현형의 적절한 단계에서 배아 및 적절한 통계적 테스트 (t-검정 또는 카이 제곱)을 사용하여 WT 인간 mRNA의 구조에 대한 결과를 비교. 결과는 그림 1을 참조하고 7 단계로 진행합니다. 분석 WT의 용량과 mRNA의 독성 효과를 제어하기 위해 혼자 돌연변이 mRNA의 주입한다. </li></ol> 6. 변형 돔의 생체 분석에기능 효과 inant 부정 이득 <ol><li> 기능 표현형의 손실이 관찰 (단계 5.5) 또는 돌연변이 발현이 MO 형 (단계 5.7)에서 유의 한 차이가 표현형에 상승을주는 경우 10-200 PG WT 인간의 발현에 이르기까지 용량 곡선을 주입 한 경우 (우리는 25, 50를 추천 및 배아 배치로 초기 테스트로 100 PG) (1-4 세포 단계; 50-100 배아 / 배치). </li><li> 적절한 단계에서 (위의 5.3 참조), 표현형 점수를 실시하고, uninjected 컨트롤에 비해 사망 및 / 또는 영향을받는 배아의 통계적으로 유의 한 번호가하지 않은 가장 높은 복용량을 결정합니다. 이것은 &quot;분석&quot;복용량이다. </li><li> 돌연변이 인간의 mRNA (, 50-100 배아 / 배치 1-4 세포 단계)의 분석 량을 주입한다. 표현형 배아 WT 인간 mRNA의 주입 또는 분석 MO 농도의 분석 복용량에서 득점에 결과를 비교합니다. 결과는 그림 1을 참조하십시오. </li><li> 결과 MO 구별하는 경우, WT 발현과 인간의 돌연변이 mRNA의 적정인간 WT와 돌연변이 mRNA의 주입과 비교합니다. 돌연변이 플러스 WT mRNA의 주입 배치로 표현형의 개선 지배적 음을 나타냅니다. 더 개선 기능의 이득을 나타냅니다. </li></ol> 7. 생체 시험 결과에 재현 <ol><li> 생체 분석의 세 번에 최소를 반복합니다. </li></ol> 8. 증거의 다른 라인과 생체 내 병원성 데이터에 Zebrafish의 통합 <ol><li> 시험관 연구에서 유전 적 혈통 내에서 데이터 (해당되는 경우), 제어 인구 주파수 데이터 (셀 기반 단백질의 안정성 분석, 세포 지방화, 신호 출력 또는 효소 활동)에 제브라 피쉬의 실험에서 얻은 병원성 데이터를 비교합니다. </li></ol>

저자는 그들이 더 경쟁 재정적 이익이 없다는 것을 선언합니다.

방법은 인간의 유전 질환의 표현형 (표 2, 그림 3) 다양한 관련 nonsynonymous 변화의 분석에 적용 할 일반적인 프로토콜을 나타냅니다 여기에 설명. 우리의 접근 방식은 질병의 표현형에 변화의 잠재적 인 영향을 평가하는 것이 유용 입증하고, 질병 메커니즘을 (예 : Bardet-Biedl 증후군에 지배적 인 부정적인 돌연변이의 기여, 주로 상 염색체 열성 질환 17)를 해부하는 데 도움이. 현재까지 제시된 의사 결정 트리의 개발을 통해, 우리는 1000 대립 유전자의 과잉을, 인과 유전 질환과 관련된 200 개 유전자를 초과 합리적인 비용과 시간에 모델링했다. 여기서 자세히 설명하지 않지만, 우리는 이러한 방법을 통해 복사 번호 변종 (CNVs를)뿐만 아니라 유전 적 상호 작용으로 유전 병변의 다른 유형을 모델링하기에 적합한 것으로 나타났습니다. 이러한 이벤트의 분석의 범위를 벗어본 발명의 방법의 설명, 그들은 근본적으로 임상 적절한 표현형을 유도하거나 악화를 결정하는 후보 유전자 (동시에 주입 유전자의 쌍을 포함)의 체계적인 테스트의 동일한 원리에 의존하지만. 예를 들어, 16p11.2 CNV의 29 유전자의 한을 해명하는 것은 주입 머리를 한 세그먼트 내에서 29 유전자 각각에 해당하는 관찰 660킬로바이트 게놈 세그먼트의 중복을 가진 환자에서 관찰 소두증, mRNA가 관련이있을 수 있습니다 크기 측정 한 성적 증명서, KCTD13의 큰 기여를 공개, 2 DPF 5 DPF에서 실시 하였다. (21)는 또한, 우리는 Bardet-Biedl 증후군과 히 르츠 프룽 질병 모두 환자의 게놈 병변의 분석 유전 적 상호 작용 모델을 사용하고 있습니다. 22 개별적으로 동시에 두 개의 임상 정체성의 원인 유전자의 MO 억제를 비교함으로써, 우리는 베이로 결과 표현형을 식별 할 수 있었다NG 시너지 상호 작용보다는 단순히 첨가제 정도. 높은 감도 (98 %)와 ciliopathies 17에 기여 변형에 대한 특이성 (&gt; 82 %)를 설립하는 데에도 불구하고, 우리는 아직 이러한 제브라 피쉬 모델에서 모든 표현형의 판독에 일반화 있는지 확인하기에 충분한 데이터가 없습니다. 이렇게하려면, 대립 유전자의 큰 숫자는 각각의 표현형 카테고리에서 테스트해야하며, 유전자 양성 또는 병원성이 될 것으로 예상. 이 임상에서 이러한 분석의 구현에 특히 중요합니다, VUSs의 기능 해석을 상기하면 진단 거짓 긍정과 거짓 부정의 강력한 이해 의사와 환자에게 이러한 결과의 전달을 동반 할 수있는 경우에만 관리를 알릴 수 있습니다. 그럼에도 불구하고, 이러한 방법은 인간의 유전 질환의 풍경의 더 나은 이해를 향해 크게 기여할 수있다. 우리는 이러한 모델은 foun의 역할을 할 것으로 예상임상 유전 정보의 향상된 해석 기초는 정확한하지만, 또한 치료 화면을 수행하는 것이 유용 모델로 채택 될 것입니다. 생체 데이터 또한 PolyPhen 23와 같은 소스에서 silico의 계산 예측에 비교 될 수있다, 24 체로, SNP에 &amp; GO 25, 또는 26 MutPred 일치를 표시합니다. 예측 데이터베이스 SNPs를 &amp; GO와 MutPred의 이전 연구에서 각각 정확도는 0.82과 0.81에 도달과 함께, 가장 정확한 것으로 밝혀졌다 있습니다. 27 우리는 소아 해부학 적 결함 (표 2, 그림 3)의 하위 집합에 대해 이러한 방법의 견고성을 설명하고 있지만, 특정 표현형이 방법으로 덜 다루기 쉬운 수 있습니다. 몇 가지 예외에도 불구하고, 우리의 프로토콜에 대한 의무가없는 질환의 세 가지 주요 클래스가 있습니다. 성인 발병 질환 (파킨슨 병 등) 배아 시스템의 모델에 도전을 나타냅니다. 음식물을 천천히ression 퇴행성 표현형 (예 : 측두엽 치매 등) 표현형을 생산하는 MO 활동의 일곱 DPF 창보다 더 많은 시간이 필요할 수 있습니다. 이러한 RNAi의 siRNA를 같은 다른 유전자 때려 눕힘 기술을 방해하거나 유전자 표적을 저하 할 수 있지만, 그것은 또한 이렇게 기간을 제한 없음으로, 특정 안정, 비 독성, 또는 MO를 28로 오래 지속되지 않습니다 것으로 나타났습니다 표현형합니다. 셋째, 같은 포유류의 폐와 같은 일부 척추 구조, 제브라 피쉬 배아에 충분히 orthologous 구조를 가지고 있지 않습니다. 우리는이 독특하고 바람직하지 않은 상황주의하지만 우리는 또한 WT 인간의 mRNA의 주입 표현형에 이르게하는 그 사건의 조사를 위해 제안 된 비상 계획을 제공하고 있습니다. 특정 질병 표현형는 추상화와 대리모의 큰 학위를 요구할 수 있습니다. 그것은 유전자의 기능을 충분히 모델과 TR 사이의 표현형 유사성을 약화 분화했다고 할 수 있습니다단말 표현형, 또는 그 제브라 피쉬의 생리는 본질적으로 인한 질병의 효과를 복잡. 이러한 경우에, 우리는 해고 이전에 생성 된 표현형의 추가 절개를하는 것이 좋습니다. 우리는이 분석에 대한 문제 표현형은 제브라 피쉬 배아에서 모델링 된 수있는 몇 가지 성공 사례를 생산했다. 예를 들어, TCF8에 돌연변이가 푹스 각막 이영양증 (FCD)과 관련된 유전자는 초기 개발이 증명서의 알려진 역할에 따라 대리 표현형 판독으로 낭배 형성의 결함을 사용하여 우리의 프로토콜을 사용하여 assayed되었다. 다른 인스턴스에서 29 예는 DNAJB6의 돌연변이에 의해 발생하는 성인 발병 근육 퇴행 위축, 우리는 인간의 삶의 첫 3-4 년에 병리 감지 근육을 잃은 있다는 사실에도 불구하고 5dpf 배아 근섬유의 표현형을 생성 할 수 있었다. 19 여기에 제시된 과도 돌연변이 모델뿐만 아니라, 다른 사람도 ADVANTA을 촬영했습니다신체 시스템의 다양한 인간 질병 모델이 과도 시스템의 GE. 하나의 예에서는, 색소 성 망막염은 망막 세포의 죽음의 결과로, 유전자 RP2의 최저로 제브라 피쉬에서 모델링 및 망막 박판 감소 하였다. 다섯 개의 돌연변이 체의 mRNA 중 4 명 구출에 실패하는 동안 인간의 야생형의 mRNA와 구조는 망막 박판의 세 층의 개발 결과. 30 인간의 감각 장애의이 모델은 형태 학적 표현형을 기반으로하지만, 그것은 또한 가능합니다 이러한 음향 놀라게하거나 억제를 전 진동 등의 자극에 대한 분석 응답. 47 최근 제브라 피쉬 모델이 아밀로이드 전구체 단백질을 통해 알츠하이머 질환 발병을 조사하기 위해 사용되었다. 31 저자는 유전자 녹다운 인간의 mRNA와 구출 할 수 모터 신경의 손상 축삭 가지가 발생했다. 마우스 모델은 미묘한 phenot 표시로이 모델은 특히 유익한 것으로 입증되었습니다ypes (단일 최저) 또는 출생 치사 (더블 최저). 개발을 통해 생체 내에서 zebrafish의 배아를 평가하는 능력은 감소 아밀로이드 전구체 단백질뿐만 아니라, 단백질의 적절한 기능에 대한 세포 및 세포 내 도메인을 모두 필요로하는 제공하는 직접적인 증거의 병원성 효과를 식별하는 데 도움이. 다른 주목할만한 모델이 포함 추가 근육 이영양증 32, 다이아몬드 Blackfan 빈혈 33, Axenfeld-Reiger 증후군 (안구 및 두개 안면 개발) 34, 염증성 장 질환 35 (항균 작용), 파킨슨 병 36 (신경과 운동 손실) 및 발작 37의 (수두증 및 과다). 보다 일반적인은 인간의 질병 표현형을 요점을 되풀이하는 것도 보여왔다 돌연변이 제브라 피쉬의 라인입니다. 1.38에 리뷰 모델은 백혈병, 흑색 종, 넓혀진 심근증, Duchenne 근육 퇴행 위축을 포함그리고 다른 많은.

유전자형을 예측 임상 적 가치의 유전 정보와 할당 기능 해석은 의료 유전학의 주요 문제를 나타내며 게놈지도의 가속 기술 및 경제적 타당성과 함께 점점 더 신랄한되고있다. 따라서 환자에서 검출 알 수없는 의미의 변형 (VUS)의 병원성을 테스트하기 위해 새로운 패러다임을 개발하고 실행하는 것이 필요하다. 이 분석은 다음 시간 및 비용 효율적인 정확해야하며, 항구 잠재적 인 임상 유틸리티로의 전환을 촉진 할 수 있습니다. 마우스가 전통적으로 인간의 질병 모델링 분야의 선택의 도구가되었습니다 동안, 제브라 피쉬는 과학적으로 경제적으로 유리한 대리로 부상하고있다. 마우스와는 달리, 제브라 피쉬의 생물학 개발 병리의 실시간 영상을 허용 배아의 광학적 인 명확성에 힘 입어 모든 발달 단계에 쉽게 적시 액세스 할 수 있습니다. <sup&gt; 1 돌연변이 제브라 피쉬 라인의 비교적 최근에 생성 기능 연구에 많은 고용 추가 테스트 및 모델링 옵션을 제공하고 있지만,이 기술은 (1,38에서 검토) 제한하고 있습니다. 뿐만 아니라 달성하기 힘든 특정 돌연변이의 노크 기능을 가진 유전자 돌연변이, 그들은 또한 단일 유전자 내 변이의 범위의 테스트를위한 중간 또는 높은 처리량 분석에 순종하지 않습니다. 중요한 시험의 하나의 제품군은 상속 모드를 알리고 중요한 세포 수준 (기능 대 기능의 게인 등 손실)에서 대립 유전자의 병원성 잠재력뿐만 아니라 정보를 제공하지만, 또한 효과의 방향 수 가족, 특히 작은 인간의 혈통은 유전자 전달의 형태에 제한된 정보를 항구. 사용 가능한 마우스 및 제브라 피쉬 모델의 사용의 추가 비교를 위해 표 1을 참조하십시오. 우리는 또한 참고다시 제브라 피쉬 모델 시스템에 내재 제한됩니다. 하지만 D. rerio는 장기 시스템의 신속한 초기 개발이, 성적 성숙은 약 3 개월이 필요합니다. 이 때문에 태아 및 소아 발병 질환이 과도 표현 모델에 가장 의무가 있습니다. 큰 화합물 화면을 수행하기위한 이상적인 반면, 유전자 돌연변이의 사용에 기여 nonsynonymous 변종의 수천의 체계적인 테스트 가능하지 않습니다, 그리고 소아 질환에 감지 할 계속합니다. 보완 테스트는 보존 개발 프로세스에 필요한 분자, 특히 때문에,이 실험 온순함, 동성의 높은 수준, 그리고 인간과 zebrafish의 단백질 간 기능의 보존을 활용 여기서 설명했다. 그림 1은 다양한 대립 유전자의 효과에 대한 테스트 및 확인 전략을 설명합니다. 두 기능의 손실 (LOF)과 지배적 인 분석을 수행 할 수 있습니다. LOF를 들어, 실험 모르의 최저와 관심의 유전자의 억제, 그리고 조사 대상 임상 표현형에 관련이있을 수 표현형에 대한 시금로 시작합니다. 또는 일반적으로 중 하나를 포함을 유도 결합 접합에 MO을 배치하여 접합을 방해하여, 억제 가까운 곳 제브라 피쉬의 현장 (tbMO 번역 차단제 모르)의 번역 시작 사이트 MO를 대상으로 번역을 차단하여도 달성 될 수있다 인트론 또는 탈선 엑손 (; sbMO 스플 라이스 차단 모르) 건너 뜁니다. 그 후, orthologous 인간의 성적에서 출장 발현이 도입되어 표현형의 정량화 할 수있는 구조를 측정한다. 분석이 설정되면, 인간의 메시지 후보자 돌연변이가 도입 WT 인간의 mRNA와 같은 효율 MO에 의한 표현형을 구출 할 수있는 능력을 분석 할 수 있습니다. 반대로, 후보 지배적 인 대립 유전자, 인간의 mRNA는 (하지만 MO) introduc입니다지배적 인 영향을 테스트 돌연변이의 도입은 인간의 임상 상태에서 관찰 것과 유사한 표현형을 유도합니다 반면 WT 인간의 mRNA는 조잡한, 제브라 피쉬의 해부학과 생리학에 영향을 미치지 않습니다 것을 기대와 ED. 이 실험은 지배적 인 영향 함수의 이득 (GOF) 또는 WT와 돌연변이 인간의 mRNA를 혼합하여 지배적 인 음성 메​​커니즘에 의해 발생하는지 해부 세밀한 추가 될 수 있으며, GOF 이벤트의 경우, WT 인간의 mRNA의 추가가 될 것으로 예상된다 무관, WT 및 돌연변이 mRNA를 혼합 지배적 인 음성 대립 유전자에 대한 반면 것은 돌연변이 메시지에 의한 표현형의 심각도를 변경해야합니다. 모든 경우에, 우리는 것이 좋습니다 주사의 모든 조합 (MO는 돌연변이 인간의 발현 등을 가진 모르 대 WT 인간의 mRNA를 바람직하게 태아의 동일한 클러치 (그림 1 참조) 내에서 수행 할 다음과 같은 해석은 다음과 같습니다. LOF 시험을위한 : <ul><li> 만약 최저돌연변이 WT 발현에 의해 동등하게 구출 할 수있는 표현형을 생산 대립 가능성이 양성이다. </li><li> 최저 표현형의 변이 구조는 최저 표현형 자체에서 구별 할 경우, 대립 유전자는 가능성 기능 null입니다. 실험 사실 널 (기능적 단백질)와 어떤 구조 능력이없는 초저 단백질의 활동 수준을 구별 할 수 없습니다. </li><li> 최저 표현형의 변이 구조가 통계적으로 MO보다 더 있지만, WT보다 더 경우이 결과는 함수의 부분적인 손실을 보여줍니다로 대립 가능성이 hypomorph입니다. </li></ul> 지배적 테스트 : <ul><li> 거기 최저 표현형은 없지만, WT의 mRNA 주입 표현형을 생성하는 경우 실험 (아래) 진행하는 경우, 비상 계획을 사용해야합니다. </li><li> WT의 mRNA에는 최저 표현형 및 사출이없는 경우에는 표현형을 생성하지 않습니다, 실험은 평소대로 진행됩니다. </li><li> 만약 주입돌연변이 mRNA의 야생 타입의 mRNA의 그것과 동일하다의, 대립 유전자는 양성이나 기능의 손실이 될 수도 있고, 분석에 실패했을 수 있습니다. 이 추가 실험이 옵션을 구별해야합니다. </li><li> 돌연변이 mRNA를 주입 미주리 최저 구별 경우 유전자 산물의 기능을 가능성이 어떤 방법으로 변경됩니다. 기능의 변화를 식별하는 야생 형 발현과 돌연변이 체의 mRNA의 적정을 실시하여야한다. </li><li> 이 적정의 결과 만 야생형의 mRNA를 구별 할 경우, 그 효과는 적정 금액으로 변화되는 돌연변이 단백질 제품은 기질로 야생 유형 단백질을 사용하는 것으로 나타났습니다. 이 지배적 인 부정적인 표현형을 나타냅니다. </li><li> 이 적정의 결과 혼자 돌연변이 mRNA의에 구별 할 수 있다면, 그것은 돌연변이 단백질 제품은 더 이상 야생 형과 같은 기능이없는 것으로 나타났습니다, 따라서 야생형 단백질 제품 사전의 양에 의해 영향을받지 않습니다전송. 이 대립 유전자 기능의 가능성이 이득인지 보여줍니다. </li></ul> 비상 계획 : <ul><li> 어떤 표현형 미주리 최저에서 제공하지 않지만 WT 발현에 존재하지 않으면 우리는 이러한 상황이 좋지 않은 것을 강조하지만, 추가 실험이 발생할 수 있습니다. WT 인간의 mRNA는 표현형을 최소화하기 위해 적정해야하며, 또한 새로운 세트 포인트로 사용할 수 있습니다. WT와 돌연변이 인간의 mRNA의 추가 coinjection는 돌연변이의 구출 능력에 따라 평가 될 수있다. </li></ul>

<table><tbody><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>Phusion High-Fidelity DNA Polymerase</td><td>NEB</td><td>M0530S, M0530L</td><td></td></tr><tr><td>DpnI restriction endonuclease</td><td>NEB</td><td>R0176L, R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Max Efficiency DH5&amp;alpha; competent cells</td><td>Invitrogen</td><td>18258-012</td><td></td></tr><tr><td>Big Dye Terminator</td><td>Applied Biosystems</td><td>4337455</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE Kit </td><td>Invitrogen</td><td>AM1340, AM1344, AM1348</td><td></td></tr><tr><td>Morpholino</td><td>Gene-Tools</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>1-phenyl-2-thiourea (PTU) </td><td>Sigma Aldrich</td><td>P7629</td><td>Prepare as 0.003% PTU in embryo media </td></tr><tr><td>Paraformaldehyde (PFA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>For embryos that must be fixed prior to phenotyping, prepare as 4%</td></tr><tr><td>Tricaine methane sulfonate</td><td>Western Chemical</td><td>N/A</td><td>For anesthetization and euthanasia </td></tr><tr><td colspan="4">&lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td>PTC-225 Tetrad Thermal Cycler</td><td>BioRad</td><td>Any equivalent thermal cycler</td><td></td></tr><tr><td>Nano Drop 2000 spectrophotometer</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SMZ 745T Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>AZ100 Stereomicroscope</td><td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DS Fi1 Digital Camera</td><td>Nikon</td><td>For color/fluorescent imaging</td><td></td></tr><tr><td>DS QiMC Digital Camera</td><td>Nikon</td><td>For black/white imaging</td><td></td></tr><tr><td>Advanced Resarch 3.2 Imaging Software</td><td>NIS- Elements</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

in vivo modeling of the morbid human genome using danio rerio

여기, 우리는 제브라 피쉬 생체 보완에 사용 잠재적으로 임상 적으로 유의 한 nonsynonymous 변화를 쿼리 분석의 발달을위한 방법을 제시한다. 제브라 피쉬 (Danio rerio)는 자신의 실험 온순함으로 인해 유용한 동물 시스템입니다, 배아, 손쉬운 시청을 가능하게 급속한 발전 전직 생체를 받아야하는 투명하고, 유전자 조작 할 수있는 이러한 측면 배아의 분석에 상당한 발전을 위해 사용할 수있다 1. 분자 프로세스 및 형태 발생 신호. 함께 촬영이 척추 모델의 장점은 소아 질병 발달 결함을 모델링 제브라 피쉬는 매우 순종하고, 어떤 경우에는, 성인 발병 질환. 제브라 피쉬의 게놈이 높은 사람 (orthologous ~ 70 %)의에 보존되어 있기 때문에, 제브라 피쉬에서 인간의 질병 상태를 요점을 되풀이 할 수 있습니다. 이 돌연변이 인간 m의 주입을 통해 하나를 수행합니다음의 지배 또는 함수 대립 유전자의 증가, 또는 함수 변형의 손실을 모방하는 유전자를 억제하는 모르 (MO) 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 활용을 유도하는 RNA. 출장 인간의 mRNA와 MO에 의한 표현형의 보완을 통해, 우리의 접근 방식은 측정, 생리학 관련 표현형을 구출하는 돌연변이 발현의 능력에 따라 인간의 단백질 서열에 돌연변이의 해로운 효과의 해석을 할 수 있습니다. 인간의 질병 대립 유전자의 모델링 MO 및 / 또는 1-4 세포 단계에서 인간의 mRNA 및 7 일 게시물 수정 (DPF)까지 표현형을 가진 제브라 피쉬 배아의 microinjection을 통해 발생합니다. 다음과 같은 프로토콜에 설명 된대로이 일반적인 전략은 질병 표현형의 넓은 범위로 확장 할 수 있습니다. 우리는 형태 발생 신호, 두개 안면, 심장, 혈관 무결성, 신장 기능, 골격근 장애 표현형뿐만 아니라, 다른 사람에 대한 우리의 설립 모델을 제시한다.

열성 및 Pseudorecessive 장애 통칭으로 불리는 기본 속눈썹. 확산, 극성, 분화 및 조직 관리를 포함한 여러 세포 운명에있는 세포 신호 역할을하는 척추 동물의 몸 계획에 거의 유비 쿼터스 구조 이러한 세포 소기관의 5 역기능은 인간의 유전 질환의 넓은 범위로 리드 ciliopathies. 6,7 하나는 이러한 임상 적 실체 Bardet-Biedl 증후군 (BBS), 망막 변성, 비만, 성선 기능 저하증, 다지증, 신장 기능 장애에 의해 특징 multisystemic 소아 질환이다가. 7 대립 유전자 병원성의 생체 내 분석에서의 개발이 필요했다 BBS 때문에) 적어도 17 유전자 7-10에서 발생하는 주로 개인 nonsynonymous 변화에 의해 유 전적으로 이질적인 장애, 그리고 BBS 가족의&gt; 25 %의 B) oligogenic 상속, 초 이형 변경의 존재를 상기BBS 유전자 (열성 주요 원인 돌연변이에 추가) 임상 투과도와 표현력을 조절 할 수 있습니다. 일반적으로 이러한 세 번째 대립 따라서 단백질의 기능에 대한 생물학적 효과의 정확한 해석을 필요로 유전 적 관점 불분명 병원성 잠재력의 nonsynonymous 이형 변화이다. 11-13 BBS14 - BBS에있는 돌연변이 부하에 기여하는 돌연변이의 병원성 가능성을 조사하기 위해, 우리는 처음 BBS1에서 식별 된 모든 과오 변경을 테스트했습니다. 우리는 다른 사람 모두 기초 신체 단백질의 손실이 평면 세포 극성의 조절 장애 (PCP, 비 정식 Wnt 신호)에 상승을주는 것으로 나타났습니다. 중간 somitic 제브라 피쉬 배아에 수렴 확장의 결함으로 낸 14이 생리학 관련 표현형 판독 값을 사용하여, 우리 BBS 유전자의 억제 단축 몸 축, 넓고 얇은 somites, 넓은, 꼬 notochords 결과 나타났습니다. 15 &lt;는/ (그림 2) MO-유도 억제 생산 낭배 형성 결함&gt;를 한모금, 생체 방법에서 서로 다른 세 가지로 득점으로 인간의 mRNA와 공동 주입 (및 재현성) 크게 이러한 표현형을 구출. 첫째, 배아는 질적 형질 기준 (표준, 클래스 I 및 Class II, 표현형 클래스에 대한 자세한 정의 15 참조)에 따라 생활 득점 하였다. 다음으로, 우리는 epiboly 동안 세포 이동을 정량 (특징 초기 발달 단계 숱이와 노른자 셀 16을 통해 세포 층으로 확산) 마이그레이션 세포를 시각화하는 형광 추적을 채용하여. 마지막으로, 우리는 krox20의 칵테일 pax2 및 평면 형태 학적 분석을 위해 장착 된 인 MyoD riboprobes와 교배 현장에서 아홉 체절 배아 체절 트렁크 길이를 측정 하였다. 이 방법은 섬모 돌연변이 공간에 500 대립 유전자를 초과 테스트하는 데 사용되었습니다. 하나혼자 공부&gt; 130 대립 유전자의 생체 내 시험의 표현형 점수의 범위를 생산, 등 전체가 양성으로 분류 하였다 (그림 1) 우리의 프로토콜에 의해 구출 표시 (WT 구조와 크게 다르지 않다) 부분은 (크게 개선 hypomorphs으로 분류 구출 ) WT 구조보다 MO에서, 그러나 더 심각한, 구출 실패는 기능 널 (MO에서 유의 한 차이가), 그리고 지배적 인 네거티브로 분류 MO에 비해 혼자 돌연변이 mRNA의 유도 표현형으로 분류 하였다. 우리는 또한 제브라 피쉬 생체 보완 분석의 민감도와 특이도를 평가했다. 특이성에 의해 확인되었다 공동 주입 일반적인 SNPs를을 (건강한 통제 집단에서&gt; 5 % 작은 대립 유전자 빈도), 이러한 17분의 14 테스트 (&gt; 82 %)에서 양성 표현형을 부여하는 것으로되고, 표시된 민감도는 98 %로 나타났다 생체 데이터와 유전 인자 충분한 t의 사이의 일치에 의해O를 BBS 혈통의 원인으로 대립 때문이다. 17 또한, 표현형 효과 immunoblotting을 및 세포 현지화 연구를 사용하여 생체 측정 (라이브 득점, epiboly 추적하고, ISH morphometrics) 체외에서 확인 된의 세 가지를 사용하여 관찰 하였다. 이러한 결과의 해석이 질병의 병인 적어도 하나의 메커니즘 사전 지식이 필요하지만,이 예제는 우리 프로토콜의 실용성과 견고성을 입증하는 증거를 제공합니다. 우리는 이후 공정한 돌연변이 검사의 실험적 증거의 여러 다른 라인과 TTC21B의 기능 분석 연구, 역행 intraflagellar 수송 단백질과 생체 점수에서 우리를 뒷받침했다. 18 지배적 인 장애 사지 거들 근육 이영양증 (LGMD)은 엉덩이와 어깨의 느린 진행되는 근육 약화의 원인, 근육 퇴행 위축의 염색체 클래스입니다. 이 유전자 나장애의 chanistically 이질적인 그룹 지배하고 열성 sarcomeric 여러 sarcolemmal에 걸쳐 돌연변이, 세포질 및 핵 단백질 모두에 의해 발생합니다. 임상 표현형과 자기 공명 영상에서 근육의 개입 증거의 프레 젠 테이션을 바탕으로, 우리는 핀란드어, 미국, 이탈리아어 가족 19에있는 지배적 인 LGMD의 원인을 조사 하였다. 매핑 된 현장 내 위치 후보자의 시퀀싱 DNAJB6에 돌연변이를 밝혀, HSP70 가족의 공동 보호자를 코딩하는 유전자는 인간의 적어도 두 개의 결합 이소 (핵 및 세포질)로 표현. DNAJB6 기능과 LGMD의 관련성에 추가 통찰력을 얻으려면, 우리는 제브라 피쉬 근육의 무결성의 역할을 하였다. 제브라 피쉬의 ortholog (dnajb6b)의 RT-PCR을 결합 블로킹 모르와 배아의 주입으로 이어졌습니다 다섯 체절 단계 빠르면 표현을 발견했습니다. 48 시간 게시물 수정에서 마스크 점수는 느린 분리를 보였다자신의 삽입 지점에서 섬유. 이 표현형의 특성은 다음 두 번째 겹치지 MO 테스트 및 WT 인간 DNAJB6 발현에 연속적으로 구출되었다. DNAJB6 기능의 손실은 근육 무결성 결함에 이르게하는 방법 쿼리하기 위해, 우리는 두 아형 인간의 성적으로 환자에서 발견 과오 돌연변이를 도입 제브라 피쉬 배아에 그들을 주입했다. WT 인간의 mRNA 주입 뚜렷한 표현형을 생성하지는 않지만, 이러한 변화는 세포질에서 설계 MO의 기능 효과의 손실을 phenocopied하지만, 핵없는 이소. 이 지배적 인 영향을 제안, 근육 표현형의 향상 정도를 보였다 돌연변이 WT 발현의 몰량의 coinjection으로 이어졌습니다. 이 개념을 테스트하기 위해 더 주사 돌연변이 WT 발현의 몰비를 변화와 함께 진행되었다. 예측과 일치 돌연변이 mRNA를 과잉, 배아 WT 유도 치사와 비교하면서WT의 N 과잉이 점진적으로 증가 구조를 생산. 이 oligimerization 등록 가능한 단백질 상호 작용을 확인하는 생체 실험으로 이어졌습니다. 이러한 변이는 세포질 DNAJB6의 antiaggregation 활동을 방해하고 돌연변이 WT 모두 매출뿐만 아니라, LOF BAG3이의 소아 양식을 일으키는 원인이 이후로는 LGMD의 pathomechanism 관련된 다른 분자 BAG3와 상호 작용을 방해 것을 보여 주었다 근육 영양 장애 20. 우리는 그 BAG3는 제브라 피쉬의 돌연변이 DNAJB6b에 의해 유도 된 표현형을 조절 할 수 있는지 물었다. WT BAG3 주입 혼자 DNAJB6 돌연변이 가진 표현형, coinjection을 생산하지는 않지만 상당히 BAG3 이러한 돌연변이 체 (19)의 병원성을 중재하는 역할을한다는 것을 시사 표현형의 심각도를 증가했다. <table border="1" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> 과도 Zebrafish의 모델 </td> &lt;TD&gt; 돌연변이 제브라 피쉬 라인 </td><td> 유전자 변형 마우스 라인 </td></tr><tr><td> 조사중인 인간의 표현형의 발병 연령 </td><td><ul><li> 산전 </li><li> 신생아 </li><li> 소아 </li></ul></td><td><ul><li> 산전 </li><li> 신생아 </li><li> 소아 </li></ul></td><td><ul><li> 산전 </li><li> 신생아 </li><li> 소아 </li><li> 성인 </li></ul></td></tr><tr><td> 가능한 표현형 </td><td><ul><li> 두개 안면 </li><li> 근육의 </li><li> 신호 </li><li> 심장의 </li><li> 신장의 </li><li> 혈관의 </li></ul></td><td><ul><li> 두개 안면 </li><li> 근육의 </li><li> 신호 </li><li> 심장의 </li><li> 신장의 </li><li> 혈관의 </li></ul></td><td><ul><li> 두개 안면 </li><li> 근육의 </li><li> 신호 </li><li> 심장의 </li><li> 신장의 </li><li> 혈관의 </li><li> 감각의 </li><li> 골격의 </li><li> 내장의 </li><li> 행동의 </li><li> 호흡의 </li><li> 생식의 </li><li> 내분비 </li><li> 대사 </li></ul></td></tr><tr><td> 사용할 때까지 시간 (출생부터) </td><td> 1~7일 </td><td> &gt; 3개월 </td><td> &gt; 6개월 </td></tr><tr><td> 처리량 </td><td> 매체 높은 </td><td> 낮은 </td><td> 낮은 </td></tr><tr><td> 장점 </td><td><ul><li> 특정 돌연변이를 테스트 할 수있는 능력 </li><li> 노크의 모델을 생성 할 수있는 능력 </li><li> 모르의 knockdowns을 사용하는 능력 </li><li> 저비용 유지 보수 </li></ul></td><td><ul><li> 적은 실험 변동 </li></ul></td><td><ul><li> 가까운 진화의 관계 </li><li> 장기 구조의 보존 </li><li> 유전자 기능속도 노크의 모델 </li></ul></td></tr></tbody></table> 표 1. 생체 모델의 비교. <img alt="표 2" src="/files/ftp_upload/50338/50338table2.jpg" fo:content-width="7in" fo:src="/files/ftp_upload/50338/50338table2highres.jpg"/> 표 2. 인간 dysmorphologies의 생체 모델링의 예. 다양한 표현형은 제시된 프로토콜에 따라 테스트. 표현형 판독 및 시각화 기술의 범위는 장애의 유형에 따라 사용될 수있다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50338/50338table2highres.jpg" target="_blank">큰 테이블을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 1" src="/files/ftp_upload/50338/50338fig1.jpg" /> 그림 1. nonsynonymous 변형의 생체 내 기능 테스트합니다. 모든 기능 테스트에 대한 체계적인 접근 방법알 수 없거나 가설을 의미 eles. 모르의 microinjection을 통해 유전자 최저는 WT와 돌연변이 인간의 mRNA의 양의 (CO) 주사의 일련옵니다. 표현형 결과의 통계 분석은 대립 유전자의 병원성 및 분자 기능을 알려줍니다. 간단히 기능 검사의 손실 : 최저는 돌연변이 WT 발현에 의해 동등하게 구출 할 수있는 표현형을 생성하는 경우, 대립 유전자 (녹색 박스) 가능성이 양성이다. 최저 표현형의 변이 구조는 최저 표현형을 구별 할 경우, 대립 유전자는 가능성 기능을 널 (노란색 상자)입니다. 최저 표현형의 변이 구조가 통계적으로 MO보다 더 있지만, WT보다 더 경우, 대립 가능성이 hypomorph (녹색 상자)입니다 지배적 인 테스트를 들면 다음과 같습니다. 돌연변이 mRNA의 주입은 야생형의 mRNA의에 해당하는 경우 , 대립 유전자는 양성이나 기능의 손실이 될 수도 있고, 분석은 (녹색 상자)가 실패했을 수 있습니다. 돌연변이 mRNA의 주입은 indis 경우<html> 미주리 최저에서 tinguishable, 유전자 산물의 기능을 가능성이 어떤 방법으로 변경됩니다. 기능의 변화를 식별하는 야생 형 발현과 돌연변이 mRNA의 적정. 이 적정의 결과 만 야생형의 mRNA를 구별 할 경우, 돌연변이 단백질 제품은 그로 인하여 지배적 인 부정적인 표현형 (파란색 상자)을 나타내는 기질로 야생 유형 단백질을 사용합니다. 이 적정의 결과 혼자 돌연변이 mRNA의로 구분할 경우, 돌연변이 단백질 제품은 더 이상 야생 형과 같은 기능이 없으며, 따라서 가능성 기능 (파란색 상자)의 이득이다. 어떤 표현형 미주리 최저에서 제공하지 않지만 WT 발현에 존재하지, 더 실험이 발생할 수있는 경우, WT 인간의 mRNA는 표현형을 최소화하기 위해 적정해야하며, 또한 새로운 세트 포인트로 사용할 수 있습니다. WT와 돌연변이 인간의 mRNA의 추가 coinjection는 돌연변이의 구출 능력 (분홍색 상자)에 따라 평가 될 수있다.그 외 = &quot;_blank&quot;&gt; 큰 그림을 보려면 여기를 클릭하십시오. <img alt="그림 2" src="/files/ftp_upload/50338/50338fig2.jpg" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50338/50338fig2highres.jpg"/> 그림 2. MKS1 변이의 양적 및 질적 평가는 인간에서 발견. 발달 결함 mks1 morphant 배아합니다. 심각도에 따라, 표현형은 세 그룹으로 분류 하였다. 각 클래스의 예 ()가 표시되고, 그 배아 집단 내에서의 유병률 (n은 = 100-160 배아) (미도시) 표로되었다. MO 같은 somitic 나이에 주입 배아 (8-9 somites)를 제어에 비해 노른자에 과도한 배아 조직으로, I 표현형은 크게 정상적인 형태를 가지고 있지만 짧았다 클래스와 배아를 주입했다. 클래스 II의 morphants는 가늘게했다, 짧은 제대로 머리와 꼬리 구조를 개발했으며, 추가 somitic 정의를 부족와 대칭. 클래스 III의 배아는 심각 제대로 개발하고 흉한 somites로 지연되었다 notochords을 파상, 일반적으로 10 체절 단계 과거 살아남을하지 않았다. 인간 MKS1 발현의 공동 주입 mks1 억제에 표현형의 특이성을 보여주는 이러한 결함의 각 구조. krox20, pax2 및 인 MyoD riboprobes 염색 11 체절 단계 (± 1 체절)에서 배아의 제자리 교잡에 (B, C ). 표현형은 처음부터 C의 양이 각각의 배아 (화살표)의 마지막 감지 체절로 측정하여 정량 하였다. 그림 15의 허가를 적응. <img alt="그림 3" src="/files/ftp_upload/50338/50338fig3.jpg" fo:content-width="3.25in" fo:src="/files/ftp_upload/50338/50338fig3highres.jpg"/> 그림 3. 인간 dysmorphology의 생체 모델링의 예. () 두개 안면 dysmorphology. 컨트롤의 mRNA는 배아를 주입 (왼쪽)과 돌연변이 주입 배아 (오른쪽) 5 DPF에서 Alcian 파란색으로 염색. 돌연변이 mRNA의 주입 배아을 포함하여 연골 두개 안면 골격의 일반적인 무질서에 특히 작고보기 흉한 머리를 표시 아가미 아치와 누락되었거나 잘못된 구조를 벌리고. (B) 마이크로 / 대두 증. 제어 5 DPF에서 배아 (왼쪽)와 kctd13 MO-주입 배아를 (오른쪽) uninjected. 눈 사이의 공간에 보이는 Morphants은 머리의 확대 표시합니다. 21 (C) 감소 혈관 무결성을. 제어 배아를 uninjected (위)와 ENG MO-주입 배아 (바닥) fli1에서 2 DPF에서 형광 현미경을 사용하여 몇 군데 : EGFP 유전자 변형 기자 라인. 마디 사이 혈관 및 기타 혈관 구조의 발아 장애인 Morphants가 표시됩니다. 41 (D) 변경된 심장 루핑. UNI의 현장 하이브리드 화에ccdc39 morphant 배아 (표시되지 않음) 양측 보여 주었다 (오른쪽) 또는 대부분의 경우, 감지 SPAW 표현하면서 njected 야생 형 배아 (왼쪽), 왼쪽 측면 판 중배엽에서 SPAW 식을 보여줍니다. 43 (E) 신장 낭종. Uninjected WT 배아 (위)와 ift80 morphant (아래). Morphants 큰 신장 낭종 (화살표), 심낭 부종 (화살촉)와 말린 꼬리가 표시됩니다. 44 (F) 감소 사구체 여과. 마음에 로다 민 덱스 트란 주사 후 배아 (위)와 ift80 morphant (아래) 24 시간 주입 컨트롤의 형광 시각화. 컨트롤의 형광의 완전한 부재와 같이 형광 혈관 시스템에 걸쳐 분산과는 거의 완전히 신장으로 대피한다. morphant 감소 된 사구체 여과를 제안, 지속 형광 덱스 트란을 표시합니다. 46 (G) 근육 영양 장애는. WT DNAJB6 씨NA 주입 배아 (상단)은 반대로 느린 마이 오신 항체를 사용하여 면역 염색에 의해 결정 인접 myosepta 사이에 일반적으로 somites에 걸쳐 정상 느린 근섬유을 보여줍니다. 돌연변이 DNAJBb (하단)은 하나 또는 여러 개의 somites에 myosepta에서 근섬유의 분리를 완료 할 부분 보였다. 19 (H) 체절 각도. 제어 uninjected (TOP) 30 HPF에서 몇 군데 kif7 morphants (아래)의 라이브 측면 뷰를 확대. Morphants는 제브라 피쉬 myotome에 신호 자궁외 고슴도치로 인한 비정상적 모양의 somites을 표시합니다. 47 모든 수치는 허가 적응.

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In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

여기, 우리는 개발을위한 체계적인 접근 방법을 제시 생리 학적 관련성이 민감하고 특정<em&gt; 생체 내</em&gt; 인간의 병리에 변화를 해석하기위한 분석. WT와 돌연변이 인간의 mRNA와 모르 (MO) 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 microinjection을 통해 과도 유전자 조작 인간 발달 장애의 맥락에서 독점적으로 신속하게 분석 병원성 특히 돌연변이, 그러나에 개발 제브라 피쉬 배아의 온순함을 활용.

Danio rerio를 사용하여 병적 인 인간 게놈의 생체 모델링에

Here,  we present methods for the development of assays to query potentially clinically  significant nonsynonymous changes using in  vivo complementation ...

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In Vivo Modeling of the Morbid Human Genome using Danio rerio

20.6K 조회수.  Duke University Medical Center. 여기, 우리는 개발을위한 체계적인 접근 방법을 제시 생리 학적 관련성이 민감하고 특정 생체 내 인간의 병리에 변화를 해석하기위한 분석. WT와 돌연변이 인간의 mRNA와 모르 (MO) 안티센스 올리고 뉴클레오티드의 microinjection을 통해 과도 유전자 조작 인간 발달 장애의 맥락에서 독점적으로 신속하게 분석 병원성 특히 돌연변이, 그러나에 개발 제브?...

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Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development of a customizable platform to rapidly generate gene modifications in a wide variety of organisms, including zebrafish. CRISPR-based genome editing uses a single guide RNA (sgRNA) to target a CRISPR-associated (Cas) endonuclease to a genomic DNA (gDNA) target of interest, where the Cas endonuclease generates a double-strand break (DSB). Repair of DSBs by error-prone mechanisms lead to insertions and/or deletions (indels). This can cause frameshift mutations that often introduce a premature stop codon within the coding sequence, thus creating a protein-null allele. CRISPR-based genome engineering requires only a few molecular components and is easily introduced into zebrafish embryos by microinjection. This protocol describes the methods used to generate CRISPR reagents for zebrafish microinjection and to identify fish exhibiting germline transmission of CRISPR-modified genes. These methods include in vitro transcription of sgRNAs, microinjection of CRISPR reagents, identification of indels induced at the target site using a PCR-based method called a heteroduplex mobility assay (HMA), and characterization of the indels using both a low throughput and a powerful next-generation sequencing (NGS)-based approach that can analyze multiple PCR products collected from heterozygous fish. This protocol is streamlined to minimize both the number of fish required and the types of equipment needed to perform the analyses. Furthermore, this protocol is designed to be amenable for use by laboratory personal of all levels of experience including undergraduates, enabling this powerful tool to be economically employed by any research group interested in performing CRISPR-based genomic modification in zebrafish.

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Targeted genome editing in the model system Danio rerio (zebrafish) has been greatly facilitated by the emergence of CRISPR-based approaches. Herein, we describe a streamlined, robust protocol for generation and identification of CRISPR-derived nonsense alleles that incorporates the heteroduplex mobility assay and identification of mutations using next-generation sequencing.

효율적인 생산 및 모델 시스템 Danio rerio 에 유전자 녹아웃 식별의 CRISPR/Cas9 생성

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

연구

유전학

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA mutation rates. Changes in replication timing occur during development and in cancer, but the role replication timing plays in development and disease is not known. Zebrafish were recently established as an in vivo model system to study replication timing. Here is detailed the protocols for using the zebrafish to determine DNA replication timing. After sorting cells from embryos and adult zebrafish, high-resolution genome-wide DNA replication timing patterns can be constructed by determining changes in DNA copy number through analysis of next generation sequencing data. The zebrafish model system allows for evaluation of the replication timing changes that occur in vivo throughout development, and can also be used to assess changes in individual cell types, disease models, or mutant lines. These methods will enable studies investigating the mechanisms and determinants of replication timing establishment and maintenance during development, the role replication timing plays in mutations and tumorigenesis, and the effects of perturbing replication timing on development and disease.

Profiling DNA Replication Timing Using Zebrafish as an In Vivo Model System

Zebrafish were recently used as an in vivo model system to study DNA replication timing during development. Here is detailed the protocols for using zebrafish embryos to profile replication timing. This protocol can be easily adapted to study replication timing in mutants, individual cell types, disease models, and other species.

DNA 복제 타이밍 Zebrafish Vivo에서 모델 시스템으로 사용 하 여 프로 파일링

DNA replication timing is an important cellular characteristic, exhibiting significant relationships with chromatin structure, transcription, and DNA ...

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance to man of conventional invertebrate model systems and the complexity of genomes in vertebrates are critical challenges to modeling human normal and pathological conditions. The chordate Ciona intestinalis is an invertebrate chordate that emerged from a common ancestor with the vertebrates and may represent features at the interface between invertebrates and vertebrates. A common body plan with much simpler cellular and genomic composition should unveil gene regulatory network (GRN) links and functional genomics readouts explaining phenomena in the vertebrate condition. The compact genome of Ciona, a fixed embryonic lineage with few divisions and large cells, combined with versatile community tools foster efficient gene functional analyses in this organism. Here, we present several crucial methods for this promising model organism, which belongs to the closest sister group to vertebrates. We present protocols for transient transgenesis by electroporation, along with microinjection-mediated gene knockdown, which together provide the means to study gene function and genomic regulatory elements. We extend our protocols to provide information on how community databases are utilized for in silico design of gene regulatory or gene functional experiments. An example study demonstrates how novel information can be gained on the interplay, and its quantification, of selected neural factors conserved between Ciona and man. Furthermore, we show examples of differential subcellular localization in embryonic cells, following DNA electroporation in Ciona zygotes. Finally, we discuss the potential of these protocols to be adapted for tissue specific gene interference with emerging gene editing methods. The in vivo approaches in Ciona overcome major shortcomings of classical model organisms in the quest of unraveling conserved mechanisms in the chordate developmental program, relevant to stem cell research, drug discovery, and subsequent clinical application.

Embryo Microinjection and Electroporation in the Chordate Ciona intestinalis

We present transient transgenesis and gene knockdown in Ciona intestinalis, a chordate sister group to vertebrates, using microinjection and electroporation techniques. Such methods facilitate functional genomics in this simple invertebrate that features rudimentary characteristics of vertebrates, including notochord and head sensory epithelia, and many orthologs of human disease associated genes.

척색에서 배아 미세 주입 및 Electroporation에<em&gt; Ciona intestinalis의</em

Simple model organisms are instrumental for in vivo studies of developmental and cellular differentiation processes. Currently, the evolutionary distance ...

발생학

High-throughput DNA Extraction and Genotyping of 3dpf Zebrafish Larvae by Fin Clipping

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short generation time, are easy to handle, display a high reproductive rate, low cost, and are easily amenable to genetic manipulations by microinjection of DNA in embryos. Recent advances in gene editing tools are enabling precise introduction of mutations and transgenes in zebrafish. Disease modeling in zebrafish often leads to larval phenotypes and early death which can be challenging to interpret if genotypes are unknown. This early identification of genotypes is also needed in experiments requiring sample pooling, such as in gene expression or mass spectrometry studies. However, extensive genotypic screening is limited by traditional methods, which in most labs are performed only on adult zebrafish or in postmortem larvae. We addressed this problem by adapting a method for the isolation of PCR-ready genomic DNA from live zebrafish larvae that can be achieved as early as 72 h post-fertilization (hpf). This time and cost-effective technique, improved from a previously published genotyping protocol, allows the identification of genotypes from microscopic fin biopsies. The fins quickly regenerate as the larvae develop. Researchers are then able to select and raise the desired genotypes to adulthood by utilizing this high-throughput PCR-based genotyping procedure.

Zebrafish have been used as reliable genetic model organisms in biomedical research, especially with the advent of gene-editing technologies. When larval phenotypes are expected, DNA extraction and genotype identification can be challenging. Here, we describe an efficient genotyping procedure for zebrafish larvae, by tail clipping, as early as 72-h post-fertilization.

높은 처리량 DNA 추출 및 지 느 러 미 클리핑에 의해 3dpf Zebrafish 애벌레의 유전형

Zebrafish (Danio rerio) possess orthologues for 84% of the genes known to be associated with human diseases. In addition, these animals have a short ...

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka and zebrafish larvae are widely used to analyze the behavior of bone cells during bone formation, degeneration, and repair. Their optical clarity allows the visualization of fluorescently labeled bone cells and fluorescent dyes bound to the mineralized skeletal matrix. Our lab has generated transgenic medaka fish that express the osteoclast-inducing factor Receptor Activator of Nuclear-factor &#954;B Ligand (RANKL) under the control of a heat&#160;shock-inducible promoter. Ectopic expression of RANKL results in the excess formation of activated osteoclasts, which can be visualized in reporter lines with nlGFP expression under the control of the cathepsin K (ctsk) promoter. RANKL induction and ectopic osteoclast formation leads to severe osteoporosis-like phenotypes. Compound transgenic medaka lines that express ctsk:nlGFP in osteoclasts, as well as mCherry under the control of the osterix (osx) promoter in premature osteoblasts, can be used to study the interaction of both cell types. This facilitates the in vivo observation of cellular behavior under conditions of bone degeneration and repair. Here, we describe the use of this system to test a drug commonly used in human osteoporosis therapy and describe a protocol for live imaging. The medaka model complements studies in cell culture and mice, and offers a novel system for the in vivo analysis of drug action in the skeletal system.

Drug Treatment and In Vivo Imaging of Osteoblast-Osteoclast Interactions in a Medaka Fish Osteoporosis Model

Small laboratory fish have become popular models for bone research on the mechanisms underlying human bone disorders and for the screening of bone-modulating drugs. In this report, we describe a protocol to assess the effect of alendronate on bone cells in medaka larvae with osteoporotic lesions.

약물 치료와<em&gt; 생체</em&gt;은 메다카 물고기 골다공증 모델에서 조골 파골 세포 상호 작용의 영상

Bone-forming osteoblasts interact with bone-resorbing osteoclasts to coordinate the turnover of bone matrix and to control skeletal homeostasis. Medaka ...

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human genetics research. Although a number of in silico algorithms have been developed to predict the pathogenicity of variants identified in these datasets, functional studies are critical to determining how specific genomic variants affect protein function, especially for missense variants. In the Undiagnosed Diseases Network (UDN) and other rare disease research consortia, model organisms (MO) including Drosophila, C. elegans, zebrafish, and mice are actively used to assess the function of putative human disease-causing variants. This protocol describes a method for the functional assessment of rare human variants used in the Model Organisms Screening Center Drosophila Core of the UDN. The workflow begins with gathering human and MO information from multiple public databases, using the MARRVEL web resource to assess whether the variant is likely to contribute to a patient&#39;s condition as well as design effective experiments based on available knowledge and resources. Next, genetic tools (e.g., T2A-GAL4 and UAS-human cDNA lines) are generated to assess the functions of variants of interest in Drosophila. Upon development of these reagents, two-pronged functional assays based on rescue and overexpression experiments can be performed to assess variant function. In the rescue branch, the endogenous fly genes are &#34;humanized&#34;&#160;by replacing the orthologous Drosophila gene with reference or variant human transgenes. In the overexpression branch, the reference and variant human proteins are exogenously driven in a variety of tissues. In both cases, any scorable phenotype (e.g., lethality, eye morphology, electrophysiology) can be used as a read-out, irrespective of the disease of interest. Differences observed between reference and variant alleles suggest a variant-specific effect, and thus likely pathogenicity. This protocol allows rapid, in vivo assessments of putative human disease-causing variants of genes with known and unknown functions.

In Vivo Functional Study of Disease-associated Rare Human Variants Using Drosophila

The goal of this protocol is to outline the design and performance of in vivo experiments in Drosophila melanogaster to assess the functional consequences of rare gene variants associated with human diseases.

Drosophila를 사용하여 질병 관련 희소한 인간 이체의 생체 내 기능적인 연구

Advances in sequencing technology have made whole-genome and whole-exome datasets more accessible for both clinical diagnosis and cutting-edge human ...

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid fissure closure. Recently, the identification of individuals with coloboma in the superior aspect of the iris, retina, and lens led to the discovery of a novel structure, referred to as the superior fissure or superior ocular sulcus (SOS), that is transiently present on the dorsal aspect of the optic cup during vertebrate eye development. Although this structure is conserved across mice, chick, fish, and newt, our current understanding of the SOS is limited. In order to elucidate factors that contribute to its formation and closure, it is imperative to be able to observe it and identify abnormalities, such as delay in the closure of the SOS. Here, we set out to create a standardized series of protocols that can be used to efficiently visualize the SOS by combining widely available microscopy techniques with common molecular biology techniques such as immunofluorescent staining and mRNA overexpression. While this set of protocols focuses on the ability to observe SOS closure delay, it is adaptable to the experimenter&#39;s needs and can be easily modified. Overall, we hope to create an approachable method through which our understanding of the SOS can be advanced to expand the current knowledge of vertebrate eye development.

Visualization of the Superior Ocular Sulcus during Danio rerio Embryogenesis

Here, we present a standardized series of protocols to observe the superior ocular sulcus, a recently-identified, evolutionarily-conserved structure in the vertebrate eye. Using zebrafish larvae, we demonstrate techniques necessary to identify factors that contribute to the formation and closure of the superior ocular sulcus.

Danio rerio Embryogenesis 동안 우수한 눈 고 랑의 시각화

Congenital ocular coloboma is a genetic disorder that is typically observed as a cleft in the inferior aspect of the eye resulting from incomplete choroid ...

Microinjection of Medaka Embryos for use as a Model Genetic Organism

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows both genetic and embryological analyses and is one of the vertebrate model organisms in which genome-wide phenotype-driven mutant screens were carried out 1, as in zebrafish and the mouse. Divergence of functional overlap of related genes between medaka and zebrafish allows identification of novel phenotypes that are unidentifiable in a single species 2, thus medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions.
To take advantage of medaka fish whose embryos are transparent and develop externally, microinjection is an essential technique to inject cell-tracers for labeling cells, mRNAs or anti-sense oligonucleotides for over-expressing and knocking-down genes of interest, and DNAs for making transgenic lines.

Medaka and zebrafish are complementary for genetic dissection of vertebrate genome functions. This protocol highlights the key points for successful microinjection into medaka embryos, an important technique for embryological and genetic analysis using medaka and zebrafish in a laboratory.

모델 생물체 유전자로 사용하기 위해 Medaka의 태아의 Microinjection

In this video, we demonstrate the technique of microinjection into one-cell stage medaka embryos. Medaka is a small egg-laying freshwater fish that allows ...

생물학

A Manual Small Molecule Screen Approaching High-throughput Using Zebrafish Embryos

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology due to their considerable degree of genetic conservation with humans. Chemical genetics entails testing the effect that small molecules have on a biological process and is becoming a popular translational research method to identify therapeutic compounds. Zebrafish are specifically appealing to use for chemical genetics because of their ability to produce large clutches of transparent embryos, which are externally fertilized. Furthermore, zebrafish embryos can be easily drug treated by the simple addition of a compound to the embryo media. Using whole-mount in situ hybridization (WISH), mRNA expression can be clearly visualized within zebrafish embryos. Together, using chemical genetics and WISH, the zebrafish becomes a potent whole organism context in which to determine the cellular and physiological effects of small molecules. Innovative advances have been made in technologies that utilize machine-based screening procedures, however for many labs such options are not accessible or remain cost-prohibitive. The protocol described here explains how to execute a manual high-throughput chemical genetic screen that requires basic resources and can be accomplished by a single individual or small team in an efficient period of time. Thus, this protocol provides a feasible strategy that can be implemented by research groups to perform chemical genetics in zebrafish, which can be useful for gaining fundamental insights into developmental processes, disease mechanisms, and to identify novel compounds and signaling pathways that have medically relevant applications.

The zebrafish is an excellent experimental organism to study vertebrate developmental processes and model human disease. Here, we describe a protocol on how to perform a manual high-throughput chemical screen in zebrafish embryos with a whole-mount in situ hybridization (WISH) read-out.

Zebrafish의 배아를 사용하여 높은 처리량 접근 수동 작은 분자 화면

Zebrafish have become a widely used model organism to investigate the mechanisms that underlie developmental biology and to study human disease pathology ...

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of energy homeostasis and obesity. The small size of zebrafish allows for assays on embryos to be conducted in a 96- or 384-well plate format, Morpholino and CRISPR based technologies promote ease of genetic manipulation, and drug treatment by bath application is viable. Moreover, zebrafish are ideal for forward genetic screens allowing for novel gene discovery. Given the relative novelty of zebrafish as a model for obesity, it is necessary to develop tools that fully exploit these benefits. Herein, we describe a method to measure energy expenditure in thousands of embryonic zebrafish simultaneously. We have developed a whole animal microplate platform in which we use 96-well plates to isolate individual fish and we assess cumulative NADH2 production using the commercially available cell culture viability reagent alamarBlue. In poikilotherms the relationship between NADH2 production and energy expenditure is tightly linked. This energy expenditure assay creates the potential to rapidly screen pharmacological or genetic manipulations that directly alter energy expenditure or alter the response to an applied drug (e.g. insulin sensitizers).

High Throughput Danio Rerio Energy Expenditure Assay

Zebrafish are an important model organism for the study of energy homeostasis. By utilizing a NADH2 sensitive redox indicator, alamar Blue, we have developed an assay that measures the metabolic rate of zebrafish larvae in a 96 well plate format and can be applied to drug or gene discovery.

높은 처리량<em&gt; 다니오 레 리오 (rerio)</em&gt; 에너지 지출 분석

Zebrafish are an important model organism with inherent advantages that have the potential to make zebrafish a widely applied model for the study of ...

Danio rerio를 사용하여 병적 인 인간 게놈의 생체 모델링에

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