在体内成像完全活跃的脑组织在清醒斑马鱼幼虫和青少年由骷髅和皮肤去除

这种方法允许斑马鱼大脑在以后的幼虫阶段的可视化，允许以以前不可能的非常详细的方式观察神经元结构。色素细胞，在后来的幼虫发育过程中出现，防止大脑清晰成像，是没有问题的，因为这种方法只是删除。使用该方法，应该可以研究在大脑幼虫发育过程中的后期发生的过程，影响突触可塑性、神经元退化或其再生的过程。

在开始实验之前，使用微管拔拔器从玻璃毛细血管中制备锋利、薄薄的玻璃针头。接下来，使用塑料巴斯德移液器将幼虫收集到直径为90毫米的培养皿中，其中含有适当的溶液。将选定的幼虫转移到一个直径35毫米的培养皿中，内含ACSF，并将一个24乘24毫米的方形玻璃盖滑入培养皿盖。

然后将实验所需的ACSF体积计算成与卡博根氧合的合适噬菌体。要嵌入幼虫，请使用巴斯德移液器将麻醉幼虫转移到立体显微镜下的安装室。如果任何幼虫仍然能够移动，不要使用鱼做实验，直到鱼完全不能移动。

当幼虫无法移动时，小心地去除多余的介质，并立即在幼虫身上加入至少一毫升的低熔化藻。将斑马鱼定向，使多面体区域朝上，尽可能靠近海藻表面。如果用倒置显微镜对幼虫进行成像，在凝固后，将含有幼虫的阿加罗斯修剪成一个小的幼虫块。

为了暴露大脑成像，在必要时修剪大脑感兴趣的区域多余的气喘，并用玻璃针在靠近但未超过感兴趣的区域时，通过皮肤进行小切口，而不会深入到组织中。在皮肤表面下几乎不移动针头，继续小心地在感兴趣的区域周围进行非常小的切口，直到感兴趣的区域的皮肤可以移除或推到一边。当组织从所有胚胎中取出时，在倒置显微镜先前准备好的成像室中加入一小滴低熔化藻类，然后用一个小铲子将180度的黄藻糖块翻转到成像室的阿加罗斯落差上。

当藻子凝固后，用新鲜的ACSF填充成像室，并开始对幼虫进行成像。在这里，可以观察到一个完整的14天后受精转基因幼虫与头骨仍然完好无损。如图所示，覆盖皮肤内的色素细胞分布在头部，干扰感兴趣的区域的荧光信号。

开放颅骨手术后，感兴趣的区域可以自由访问，进行详细的高分辨率成像。皮肤、头骨或血脑屏障也阻碍物质进入大脑，这些脑细胞中仅在开放性头骨手术后观察到的强力核染料染色就说明了这一点。这些优势在施肥后30天内也观察到。

在含有荧光脑血管的转基因鱼类中，由于红荧光蛋白的表达，mCherry在内皮细胞中，图像堆栈深度值的颜色编码表明，即使是深埋在大脑内近250微米的血管，仍然清晰可见和可追溯。执行此程序时，请始终记住，这是活体动物的手术。因此，它需要尊重和专注的头脑。

在此程序之后，神经元形态的记录，包括突触结构，生理和细胞内传输事件可以在受精后7天以上的幼虫中进行。通过这项技术，我们希望提供一种方法，允许研究大脑中在幼虫晚期发生的细胞过程，并参与建立诸如社会行为或决策等复杂行为。