我们想感谢下列人员或资金支持：BBSRC研究所战略方案基金 - CF＆TMW; BBSRC东生物DTP资金 - LG;爱丁堡的达尔文信托 - MLH。我们还要感谢巴里·麦科尔医生的许可，包括在这个手稿的TREM2优化。

<ol>
	<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Protocols on CD-ROM. , (1998).</li><li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblotting+and+immunodetection.">Immunoblotting and immunodetection.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10 (2008).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PLoS One. 8 (8), 72457 (2013).</li><li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+Western+blots.">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots.</a> Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).</li><li>Colella, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Zellner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples.">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).</li><li>Kielar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+axonal+and+synaptic+pathology+in+mouse+models+of+Batten+disease.">Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease.</a> Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).</li><li>Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+proteomics+identifies+Calreticulin+and+GRP75/Mortalin+as+peripherally+accessible+protein+biomarkers+for+spinal+muscular+atrophy.">Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy.</a> Genome Med. 5 (10), 95 (2013).</li><li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+ubiquitin+homeostasis+and+&#946;-catenin+signaling+promote+spinal+muscular+atrophy.">Dysregulation of ubiquitin homeostasis and &#946;-catenin signaling promote spinal muscular atrophy.</a> J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 .</li><li>Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+systems+for+westerns:+chemiluminescence+vs.+infrared+detection.">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li><li>Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GalR1,+but+not+GalR2+or+GalR3,+levels+are+regulated+by+galanin+signalling+in+the+locus+coeruleus+through+a+cyclic+AMP-dependent+mechanism.">GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism.</a> J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).</li><li>Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+signaling+events+in+Drosophila+S2+cells.">Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells.</a> Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).</li><li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+proteomics+analysis+of+synaptic+proteins+identifies+potential+cellular+targets+and+protein+mediators+of+synaptic+neuroprotection+conferred+by+the+slow+Wallerian+degeneration+(Wlds)+gene.">Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+western+blot+analysis.">The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis.</a> J. Vis. Exp. (84), 51149 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

由于考虑和计划是之前的任何实验必不可少，并且可以最终确定所使用的技术的成功。用WB可以呈现过多的潜在绊脚石试图选择合适的抗体，转移和可视化方法使用时，在蛋白质检测的进步。幸运的是，通过仔细的检查表和QFWB可常规用于确定蛋白质的存在和样品之间日益微妙的表达差异适当的控制措施。该协议提供了一个全面的指南，以荧光定量免疫印迹以及一些解决问题的策略，以避免和/或克服一些与此相关的许多常见的陷阱。 用来维持灵敏度，将获得的关键步骤真正量化和可比较的测量包括：1）鲁棒蛋白提取自组织样品; 2）样品制备; 3）准确的蛋白质插件中克以总蛋白质分析测定; 4）优化利用I-Blot检测蛋白的转移; 5）使用红外成像器和相关联的软件准备一级和二级抗体在阻断含0.1％吐温20缓冲液，和6）正确的可视化和分析。 红外荧光检测是真正的量化，并与更传统的电化学发光检测技术3,11相比提供了更高的灵敏度。该检测系统是多面性的，因此并不限定于QFWB。该系统能够免疫组化标记成像在低功耗，允许可视化的整个组织切片12和量化。这是未来发展潜力的一个区域在分辨率方面可能远远看见红色的成像媲美常规免疫捕获与传统的显微镜定量评估方面。 然而，与在P微妙的变化更加敏感rotein表达关键的是要确保变性保持在最低限度和控制措施是严格的具有强大的协议。这开始于严谨蛋白提取组织样本随后生产总蛋白质染色的凝胶以提供保证样品装载是均匀的，第一和第二抗体，以确定是否检测是真实的，对于测试制造商的指导方针来传输优化次，以获得有效的蛋白转移。 然而，即使当用于白平衡的条件进行了优化，但仍然可以使用运行西部片可能未得到充分这里探讨了相关的问题。这些包括但不限于因素，包括蛋白质溶解和选择的提取缓冲液。某些缓冲剂能与蛋白质浓度测定干扰，和一些组织中是特别难以溶解，因此需要更强大的技术，例如利用自动macera鼎密封容器如M管连同Mac机离解。此外，对于存储提取和非萃取材料在-80℃下的简单的控制措施可以是提取后立即获得最佳标记和具有较差的结果周后之间的差。 现代QFWB方法被证明是用于捕获在蛋白质表达的细微差别更敏感，更通用的允许同时双标记3时相比，如ECL旧的技术。至关重要的是，免疫​​印迹协议是强大和易于重复进行准确的定量和统计分析。这个协议是敏感的和强大到足以被常规用于检测蛋白的跨各种不同的组织样本和物种3，并且允许低和高丰度蛋白质的定量相同QFWB内，因此减少了耗材使用以及每个实验1时间1此外，该技术的敏感性增加使得越来越流行的验证- 组学研究9,14然而精度是至关重要的，并包含合适的控制措施，必须遵守从而避免错误的数据采集。

Western印迹法（WB）是最初在20世纪70年代后期，以确定所关注的蛋白的存在或不存在下在一个复杂的生物样品，如组织匀浆1的分析技术。通常被称为该蛋白质的免疫印迹中，由于密钥抗体 - 抗原相互作用，该方法包括5个不同的步骤：蛋白质通过等电点为1）电泳分离; 2）转移到硝酸纤维素或聚偏二氟乙烯（PVDF）膜; 3）使用特异于目的蛋白质的初级抗体标记; 4）培养用针对第一抗体的第二抗体;和5）的可视化。 可视化的方法已演变随着时间的推移，以提高安全性和灵敏度。一些第一转债的进行了使用放射性标记的标签，然后进展到比色，然后更广泛使用的化学发光（ECL）方法。 Radioactivi一节被直接标记到探针的特异性抗原，而比色和ECL方法使用用酶记者间接标记技术，如碱性磷酸酶或链霉抗辣根过氧化物酶（HRP）2。的发色或发光产物的标记的强度是使用光密度测定，由此，信号强度，或强或弱，表明样品中目的蛋白质的或多或少的存在下进行测定。 ECL是比较敏感的，所以青睐的方法2，但所有的3种方法最初开发于X射线胶片与随后成立3更先进的数码影像技术。 WB的数字成像的进步不仅允许研究者来确定感兴趣的蛋白的存在或不存在的，但也允许一个推理到一个选定的蛋白质的表达水平，当与其他样品相比，因此可被称为“半定量＆＃8221 ;.最近，一个真正的定量和更灵敏的免疫印迹技术已经发展，由此进行荧光测定的水平，直接关系到一个样品中的量和单个蛋白的表达：定量的荧光蛋白质印迹（QFWB）。 当与ECL标记比较QFWB，利用荧光第二抗体的产生线性检测曲线4。这是相对于电致化学发光技术，其中，信号的线性度通常发生在低于5微克和信号饱和度低的蛋白质负载直接相关的蛋白的表达， 即，与遍在表达的持家基因5,6。这种差异很可能是由一个更大数量的结合位点，可用于抗生物素蛋白ECL底物结合到生物素化的次级，导致潜在的信号饱和的较高可能性引起的。这是被称为外核层的ECL基础免疫的重要原因之一Y“半定量”7。测定的表达水平的细微差异时，可能导致不准确的测量信号的饱和点是至关重要的。近年来广泛蛋白质组技术细节不断增加的敏感性和鉴别的微妙表达差异的出现，导致了日益增加的依赖真正的定量免疫印迹法进行验证实验，8,9。敏感，稳健​​和真正的定量方法的应用是至关重要的。 很多“优化”免疫印迹方法已经使用了独立的实验室，这经常被证明难以成立或复制，由于可能无法在正式的文件协议明显微妙的方法上的调整。这是一个既定的和强大的协议QFWB并另外提供了宝贵的战略，解决常见问题THA实现在t可能出现。 该协议最初是为与鼠脑匀浆进行了优化，但已经被在广泛的组织样本和物种4,9,10的有效利用。需要具体问题进行故障排除潜在协议的变化都包括在内。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:427px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10230544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">M Tubes</td>
			<td style="width:255px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:427px;">iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>IB401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5602</td>
			<td>Use in gel 1 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">SeeBlue Pre-stained protein standard</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5625&#160;</td>
			<td>Use in gel 2 Total protein stained gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAge LDS Sample buffer 4X</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Micro BCA, Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10249133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Odyssey&#160; blocking buffer</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td>P/N 927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">ODYSSEY CL Infra-red imager</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Call for quotation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">iBlot 7-Minute Blotting System</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This model is no longer in production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">InstantBlue Protein stain</td>
			<td style="width:255px;">Expedeon, UK</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Revitablot western blot stripping buffer&#160;</td>
			<td>Rockland Immunochemicals Inc.</td>
			<td>MB-085-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies

20世纪70年代末看到的第一个公开报道使用免疫印迹，评估的存在和复杂生物样品中的特定蛋白质的相对丰度的技术的。此后，免疫印迹方法已成为分子生物学家的实验剧目的共同组成部分。表明，超过22万的手稿出版已在2014年取得了重要的应用这一技术的考研用的术语“免疫印迹”粗略搜索，在过去十年里，再加上技术的发展进步成像敏感的荧光标记物具有改进的灵敏度，并且得到线性检测的更大的范围。其结果是基于西方的印迹（QFWB）现在一个真正可量化的荧光，使生物学家进行对比分析，表达与更高的灵敏度和精确度比以往任何时候。很多“优化”印迹方法存在，被用于不同的实验室。这些通常难以实现，由于微妙的，但没有证件的程序修正的要求。该协议提供了一个既定的和强大的QFWB方法的全面描述，完整的故障排除策略。

作为QFWB灵敏度和检测的线性范围大于常规ECL检测，也有一些地方是至关重要，以确保精确的数据收集的控制措施，从而有助于有效的解释。首先，包含阳性对照样品， 如图1;其次，转移的优化，以保证从凝胶向膜的高和低分子量蛋白质的等效运动为展示在图2中 ，第三，抗体的优化，特别是二次抗体的优化往往被忽视，但它可以产生非特异性条带能够与感兴趣的蛋白（S）的正确解释干扰。参见图3。第四，它也可能是这种情况，当一个蛋白似乎检测不到的，但预计将存在，这也可以是次级抗体的问题，可以通过简单地使用一个次级rais的被校正编在不同的寄主。参见图4。第五，总蛋白标记和分析是相比于使用传统的单一蛋白（多个）被普遍表达作为内部参考标准3的一个更为健壮的，可量化的方法。许多这些单个的蛋白质被发现差异表达在神经退行性疾病的模型以及与不同的组织样本和表达的均匀性可以在相同的组织中3改变。因此，生产上样对照凝胶的将确认样品负荷的均匀性，总蛋白分析，通过比较和定量蛋白质负荷在每个泳道下，在对每一个样品测定不同分子量范围的组合时，表示标准误差为展示图6中的。重要的是，所有这些故障排除技术和控制是只一样有效的分析吨的灵敏度和一致性由操作者（ 图5）施加ools。最后这种技术适合于汽提和再探测膜具有比ECL更多灵活性因包括但不限于增加的敏感性，降低的背景，双色检测和膜稳定性长期储存条件下的因素。 见图7。

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies at JoVE.com

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

指南现代荧光定量免疫印迹与故障排除策略

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

a-guide-to-modern-quantitative-fluorescent-western-blotting-with

Research

JoVE Journal

Biology

50.7K 次观看.  University of Edinburgh. The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.