研究蛋白质精氨酸甲基转移酶1-9细胞活性的方法

本程序的目的是测量细胞中蛋白质精氨酸甲基转移酶家族个体成员的酶活性。该活性通过使用定量荧光西印来确定其精氨酸甲基化水平和生物标记蛋白的总水平来衡量。上述方法的优点是具有细胞培养和荧光西斑功能的任何实验室的简单性能。

本文提供了有关生物标记物、抗体和抑制剂两种化合物的详细指南。在这里，我们描述了实验过程中的关键步骤。并且该程序显示为 24 个井格式。

首先，在使用前先准备裂解缓冲剂，加入苯甲酶和蛋白质抑制剂鸡尾酒。从井中删除所有介质。用100微升PBS清洗，并在井中加入60微升裂解缓冲器。

在室温下孵化一分钟，摇动板，将裂解缓冲器分配到细胞上。然后加入三个微升的20%SDS，以找到1%的浓度，并通过轻轻摇动混合。将利萨酸盐转移到埃彭多夫管中，并将其保持在冰上。

使用 BCA 蛋白质检测套件确定样品的蛋白质浓度，或使用任何其他在溶液中耐受 1% SDS 的方法。用裂解缓冲器调整蛋白质浓度后，在样品中等于20微升，将缓冲器加载到60微升细胞裂解剂，并在95度加热5分钟。在裂解缓冲中加入苯二氮酶可快速水解核酸，从而降低细胞裂解粘度。

带苯甲酸酯的莱萨特不粘稠。没有苯甲酸酯的裂解物有一个大球状的鹅DNA，不会颗粒时旋转。加载到5至20微克的总细胞裂解物的希斯通蛋白，20至100微克的其他蛋白质在梯度4至12个二重奏蛋白质凝胶。

在拖把中的果冻周围作为周围的缓冲区，在100伏特处大约两个小时，或直到蓝色加载染料到达凝胶底部。如果您执行湿转移，在冰冷的三甘氨酸转移缓冲区组装转移三明治。通过在转移缓冲中浸泡甲醇和平衡凝胶激活 PVDF 膜，在组装前 30 秒。

根据制造商的说明放置海绵滤纸、PVDF 膜和凝胶。在冰上以70伏特的速度在三甘氨酸中转移蛋白质，一到一个半小时。转移后，在阻塞缓冲区中孵育膜 30 分钟。

用洗涤缓冲器冲洗，并在四度下用主要抗体孵育。第二天，用洗涤缓冲器洗膜三次，用荧光标记的二次抗体孵育30分钟，用洗涤缓冲器洗3次5分钟。将膜朝下放在荧光西印成像仪的玻璃板上。

用橡胶板盖住，并去除任何气泡。读取700和800纳米的信号。扫描完成后，转到图像并调整 700 和 800 通道信号以清楚地看到波段。

在这里，显示为红色的 700 通道信号表示总蛋白质水平，显示为绿色的 800 通道信号表示甲基化蛋白水平。接下来，转到分析并选择上下读数中位数。要测量频段强度，请选择绘制矩形工具，并在想要量化的波段周围绘制形状。

转到您发现 700 和 800 通道的特性的形状。称为信号的列提供强度水平，并减去背景。结果可直接复制到 Excel 文件。

下面是使用 PRMT 类型一型抑制剂 MS023 在抑制细胞中对 PRMT1 活性进行分析的示例。PRMT1 活性通过确定高石 H4 精氨酸 3 不对称二甲基化水平来测量。在这里，甲基化水平，绿色带下降在剂量依赖的方式，而总的高石水平红带保持不变。

要确定化合物IC50，绘制抑制剂浓度与高石H4精氨酸-3非对称二甲基化水平正常化到总高石水平的对数，然后进行非线性拟合分析。上述方法允许对蛋白质甲基转移酶在细胞中的活性进行负责和可重复的双重检测。该方法的优点是，它利用了众所周知的西方印迹方法，可供学术实验室使用，并且可以根据实验室设备进行易于修改。

本文提供了每个PRMT家族成员的检测细节，包括生物标记蛋白、抗体和化学两种化合物。