Wir würden dank mag die folgenden für die finanzielle Unterstützung: BBSRC Institut Strategische Programmfinanzierung - CF &amp; TMW; BBSRC East Bio DTP Finanzierung - LG; Die Darwin Trust of Edinburgh - MLH. Wir möchten auch an Dr. Barry McColl für die Erlaubnis, die TREM2 Optimierung in diesem Manuskript gehören danken.

<ol>
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A., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+signaling+events+in+Drosophila+S2+cells.">Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells.</a> Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).</li><li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+proteomics+analysis+of+synaptic+proteins+identifies+potential+cellular+targets+and+protein+mediators+of+synaptic+neuroprotection+conferred+by+the+slow+Wallerian+degeneration+(Wlds)+gene.">Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).</li><li>Silva, J. 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The authors have nothing to disclose.

Berücksichtigung und Planung ist wichtig vor jeder Experiment und kann letztlich bestimmen den Erfolg der verwendeten Technik. Die Fortschritte in Proteindetektion mit WB kann eine Fülle von potenziellen Stolpersteine ​​darstellen, wenn sie versuchen zu entscheiden, die entsprechenden Antikörper, Transfer und Visualisierungsmethoden zu bedienen. Glücklicherweise mit einer sorgfältigen Checkliste und geeignete Kontrollmaßnahmen QFWB kann routinemäßig verwendet werden, um die Protein Präsenz und immer subtiler Expressionsunterschiede zwischen den Proben zu bestimmen. Dieses Protokoll bietet einen umfassenden Leitfaden für fluoreszierende quantitativen Western Blot sowie ein paar Fehlersuchstrategien zur Vermeidung und / oder zu überwinden einige der vielen Fallstricke mit ihm verbunden. Die kritischen Schritte verwendet, um die Empfindlichkeit zu erhalten und zu erhalten wirklich quantifizierbare und vergleichbare Messungen umfassen: 1) robuste Proteinextraktion aus Gewebeproben; 2) Probenvorbereitung; 3) genaue Protein loading bestimmt durch die Gesamtproteinanalyse; 4) eine optimale Übertragung von Proteinen unter Verwendung von I-Blot; 5) Herstellung von primären und sekundären Antikörper in Blockierungspuffer, enthaltend 0,1% Tween 20, und 6) richtige Visualisierung und Analyse unter Verwendung eines Infrarot-Bildwandler und der zugehörigen Software. Infrarot-Fluoreszenzdetektion ist wirklich quantitative und bietet eine höhere Empfindlichkeit gegenüber traditionelleren ECL-Nachweistechniken 3,11. Dieses Erfassungssystem ist mit mehreren Facetten, und als solche ist nicht auf QFWB beschränkt. Dieses System ist in der Lage Bildgebung von immunhistologischen Kennzeichnung bei niedriger Leistung ermöglicht die Visualisierung und Quantifizierung der gesamten Gewebeabschnitte 12. Dies ist ein Bereich von möglichen zukünftigen Entwicklung hinsichtlich der Auflösung, die weit roten Bildgebung sehen konnte rivalisierenden herkömmlichen Immunfluoreszenz Capturing mit herkömmlichen Mikroskopen im Hinblick auf quantitative Bewertung. Jedoch mit größerer Empfindlichkeit, um feine Änderungen in protein Ausdruck es entscheidend, Variabilität zu gewährleisten wird auf ein Minimum und Kontrollmaßnahmen gehalten sind streng mit robuster Protokolle. Dies beginnt mit strengen Proteinextraktion aus der Gewebeprobe, gefolgt von Produktion von Gesamtprotein gefärbten Gelen die Gewähr zu bieten, dass der Probenbeladung ist einheitlich, Optimierung der Primär- und Sekundärantikörper, um festzustellen, ob Erkennung ist real und Richtlinien des Herstellers testen bezüglich übertragen Zeiten, um eine effiziente Proteintransfer erhalten. Dennoch, auch wenn die Bedingungen für WB optimiert sind, kann es immer noch Probleme mit fließendem Western, die hier nicht vollständig erforscht worden sind, können assoziiert. Diese umfassen, sind aber nicht auf Faktoren einschließlich Protein Solubilisierung und Wahl der Extraktionspuffer begrenzt. Einige Puffer mit Proteinkonzentration Assays stören und einige Gewebe sind besonders schwierig zu solubilisieren, erfordern robustere Techniken wie die Verwendung von automatisierten macerating verschlossenen Behältnissen wie M Rohre zusammen mit einem Macs Dissociator. Zusätzlich können einfache Maßnahmen zur Kontrolle der Speicherung von nicht-extrahierten und extrahierten Materials bei -80 ° C der Unterschied zwischen den Erhalt optimaler Kennzeichnung direkt nach der Extraktion und mit schlechten Ergebnissen Wochen später. Moderne QFWB Methoden sind nachweislich für die Erfassung feine Unterschiede in der Proteinexpression empfindlicher zu sein und sind vielseitiger die gleichzeitige Doppelmarkierungen 3 im Vergleich zu älteren Techniken wie ECL. Es ist lebenswichtig, dass Western-Blot-Protokolle sind robust und leicht wiederholbaren für genaue Quantifizierung und statistische Analyse. Dieses Protokoll ist empfindlich und robust genug ist, um routinemäßig für den Nachweis von Proteinen in einer Vielzahl von verschiedenen Gewebeproben und 3 Arten verwendet werden und ermöglicht die Quantifizierung von niedrigen und hohen Fülle Proteine ​​innerhalb derselben QFWB daher reduziert Verbrauchs Nutzung sowie Zeit pro Experiment 1. 1 Darüber hinaus ist die erhöhte Empfindlichkeit dieser Technik ermöglicht die Validierung von immer beliebter - schaftlichen Studien 9,14 aber Genauigkeit ist entscheidend und Aufnahme geeigneter Kontrollmaßnahmen müssen eingehalten werden, um dadurch eine fehlerhafte Datenerfassung vermieden.

Western Blot (WB) ist eine analytische Technik, die ursprünglich in den späten 1970er Jahren entwickelt, um die Anwesenheit oder Abwesenheit eines Proteins von Interesse in einer komplexen biologischen Probe zu bestimmen, wie ein Gewebe-Homogenat 1. Gemeinhin als Protein Immunoblot bezeichnet, aufgrund der Schlüssel Antikörper-Antigen-Wechselwirkung, die Methode besteht aus 5 Einzelschritten: 1) elektrophoretische Trennung der Proteine ​​nach ihrem isoelektrischen Punkt; 2) Übertragung auf eine Nitrocellulose oder Polyvinylidendifluorid (PVDF) Membran; 3) Markieren mit einem primären Antikörper, der spezifisch an das Protein von Interesse; 4) Inkubation mit einem gegen den primären Antikörper gerichtet sekundären Antikörper; und 5) Visualisierung. Visualisierung Methodik wurde mit der Zeit, um die Sicherheit und die Empfindlichkeit zu verbessern entwickelt. Einige der ersten WB wurden mit radioaktiv markierten Tags, die dann fortgeschritten, kolorimetrische und dann die weitere Verbreitung chemilluminescent (ECL) Verfahren durchgeführt. Radioactivity wurde direkt auf Sonden für spezifische Antigene markiert und ECL wohin kolorimetrische Methoden verwenden eine indirekte Markierungstechnik mit einem Enzym-Reporter, wie alkalische Phosphatase oder Meerrettich-Peroxidase-Streptavidin (HRP) 2. Die Intensität der Markierung des Chromagen oder lumineszierende Produkt wird mit Densitometrie, wobei die Signalstärke, stark oder schwach, zeigt mehr oder weniger das Vorhandensein des Proteins von Interesse in der Probe gemessen. ECL ist die empfindlicher und daher favorisierte Methode 2, aber alle drei Verfahren wurden zunächst auf einem Röntgenfilm mit anspruchsvolleren digitalen bildgebenden Verfahren nachträglich herausstellt, 3 entwickelt. Die Weiterentwicklung der digitalen Abbildung von WB nicht nur erlaubt, einen Forscher, um die Anwesenheit oder Abwesenheit der Protein von Interesse zu bestimmen, sondern auch erlaubt einen Rückschluss auf das Niveau der Expression eines ausgewählten Proteins, als gegen andere Proben verglichen und daher bezeichnet als &quot;semi-quantitative &amp; #8221 ;. Kürzlich wurde ein wirklich quantitative und empfindlichere Western Blotting Technik entwickelt worden, die das Niveau der Fluoreszenz gemessen wird, direkt auf die Menge und die Expression eines einzelnen Proteins in einer Probe bezogen werden: quantitative Fluoreszenz Western Blot (QFWB). Beim Vergleich QFWB mit ECL Kennzeichnung, die Verwendung eines fluoreszierenden sekundären Antikörper erzeugt ein lineares Erfassungsprofil 4. Dies steht im Gegensatz zu ECL Techniken, bei denen Signallinearität tritt in der Regel mit niedrigen Proteinlasten unter 5 ug und Signalsättigung direkt auf Proteinexpression bezogen, dh mit ubiquitär exprimierten Housekeeping-Gene 5,6. Diese Ungleichheit wird wahrscheinlich durch eine höhere Anzahl von Bindungsstellen zur Verfügung für eine Avidin-ECL-Substrat, der einen biotinylierten sekundären binden, was zu einer höheren Wahrscheinlichkeit möglicher Signalsättigung verursacht. Dies ist einer der Hauptgründe für die ECL Basis Immunoblotting ist als ONL bezeichnety &quot;semi-quantitative&quot; 7. Der Sättigungspunkt des Signals ist von entscheidender Bedeutung bei der Messung von feinen Unterschieden in Expressionsniveaus und zu ungenauen Messungen führen. In den vergangenen Jahren das Aufkommen von verbreiteten Proteomiktechniken Detaillierung immer höheren Empfindlichkeit und Identifizierung von subtilen Expressionsunterschiede hat eine ständig zunehmende Abhängigkeit von wirklich quantitative Western-Blotting-Experimente zur Validierung 8,9 resultierte. Die Anwendung von empfindlichen, robust und wirklich quantitative Methodik ist daher von entscheidender Bedeutung. Viele &quot;optimiert&quot; Western-Blot-Methoden wurden von unabhängigen Labors, die häufig als schwierig erweisen aufgrund subtiler methodische Anpassungen, die nicht offensichtlich in der formalen dokumentierten Protokolle sein kann zum Einrichten oder replizieren genutzt. Dies ist eine etablierte und robustes Protokoll für QFWB und zusätzlich wertvolle Strategien für die Problembehandlung gemeinsame Probleme that kann bei der Umsetzung entstehen. Dieses Protokoll wurde ursprünglich zur Verwendung mit murinen Gehirnhomogenaten optimiert, aber seitdem effektiv über einen weiten Bereich von Gewebeproben und Arten 4,9,10 verwendet. Mögliche Protokollvarianten für spezifische Problembehandlung erforderlich sind, enthalten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:427px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10230544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">M Tubes</td>
			<td style="width:255px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:427px;">iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>IB401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5602</td>
			<td>Use in gel 1 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">SeeBlue Pre-stained protein standard</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5625&#160;</td>
			<td>Use in gel 2 Total protein stained gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAge LDS Sample buffer 4X</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Micro BCA, Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10249133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Odyssey&#160; blocking buffer</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td>P/N 927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">ODYSSEY CL Infra-red imager</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Call for quotation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">iBlot 7-Minute Blotting System</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This model is no longer in production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">InstantBlue Protein stain</td>
			<td style="width:255px;">Expedeon, UK</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Revitablot western blot stripping buffer&#160;</td>
			<td>Rockland Immunochemicals Inc.</td>
			<td>MB-085-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies

Die Ende der 1970er Jahre sah die erste öffentlich berichtet Nutzung des Western-Blot, eine Technik für die Beurteilung des Vorliegens und relative Häufigkeit bestimmter Proteine ​​in komplexen biologischen Proben. Seitdem hat Western Blot Methode sich zu einem gemeinsamen Komponente des Molekularbiologen experimentellen Repertoire. Eine oberflächliche Suche in PubMed mit dem Begriff &quot;Western-Blot&quot; legt nahe, dass mehr als 220.000 veröffentlichten Manuskripte Verwendung dieser Technik bis zum Jahr 2014. Wichtig ist gemacht, haben die letzten zehn Jahre technische Bild Fortschritte gekoppelt mit der Entwicklung gesehen empfindlicher Fluoreszenzmarkierungen, die Empfindlichkeit verbessert und lieferte noch größere Bereiche der linearen Detektion. Das Ergebnis ist ein jetzt wirklich quantifizierbare Fluoreszenz Western Blot (QFWB), die Biologen die Durchführung vergleichender Expressionsanalyse mit größerer Empfindlichkeit und Genauigkeit als je zuvor ermöglicht. Viele &quot;optimiert&quot; Western-BlotMethoden existieren und werden in verschiedenen Laboratorien verwendet. Diese erweisen sich oft als schwierig zu implementieren aufgrund der Anforderung der subtilen, aber nicht dokumentierte Verfahrensänderungen. Dieses Protokoll stellt eine umfassende Beschreibung eines etablierten und robusten QFWB Verfahren, komplett mit Fehlersuchstrategien.

Als QFWB Empfindlichkeit und den linearen Bereich der Erfassung größer ist als herkömmliche ECL-Nachweis, gibt es eine Reihe von Kontrollmaßnahmen, die von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, daß genaue Daten gesammelt werden, wodurch eine effektive Auslegung unterstützt wird. Erstens die Aufnahme von positiven Kontrollproben, wie in 1 gezeigt ist. Zweitens, die Optimierung der Übertragung auf äquivalente Bewegung der hohen und niedrigen Molekulargewichts-Proteine ​​aus dem Gel auf die Membran zu gewährleisten, wie in Figur 2 gezeigt wird. Drittens, die Optimierung der Antikörper, insbesondere Sekundär Antikörper, deren Optimierung wird oft übersehen, die aber können unspezifische produzieren Banding in der Lage, sich störend auf korrekte Interpretation der Protein (e) von Interesse. Siehe 3. Viertens kann es auch der Fall sein, dass, wenn ein Protein scheint nicht nachweisbar, aber voraussichtlich anwesend zu sein, kann dies auch ein sekundärer Antikörper Frage, die durch die Verwendung eines sekundären rais korrigiert werden kannin einer anderen Spezies Host ed. Siehe 4. Fünftens ist die Gesamtproteinmarkierung und Analyse eine weitaus robuster und quantifizierbare Verfahren im Vergleich zu der Verwendung von herkömmlichen, Protein (e), die ubiquitär internen Referenzstandards 3 ausgedrückt werden. Viele dieser Einzelproteine ​​gefunden wurden differentiell in Modellen neurodegenerativer Erkrankungen sowie zwischen verschiedenen Gewebeproben ausgedrückt werden und die Gleichförmigkeit des Ausdrucks innerhalb des gleichen Gewebes 3 ändern. Daher wird die Produktion eines Ladesteuer Gel die Gleichförmigkeit der Probenbeladung zu bestätigen, wenn mit einer Gesamtproteinanalyse durch Vergleichen und Quantifizierung der Proteinbelastung in jeder Spur in verschiedenen Molekulargewichten im Bereich vor jedem Muster kombiniert werden, um Standard-Fehler anzuzeigen, wie in 6 gezeigt, . Wichtig ist, dass alle diese Techniken zur Fehlerbehebung und Kontrollen sind nur so effektiv wie die Sensitivität und Konsistenz der Analyse tools durch den Betreiber (5) aufgebracht wird. Schließlich eignet sich dieses Verfahren zum Abziehen und Wieder Sondieren von Membranen mit mehr Flexibilität als ECL aufgrund von Faktoren, einschließlich, aber nicht zu einer erhöhten Empfindlichkeit, verringert Hintergrund, dual Farberkennung und Membranstabilität unter Langzeitlagerungsbedingungen beschränkt. Siehe Abbildung 7.

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A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

A Guide to Modern Quantitative Fluoreszenz Western Blot mit Strategien zur Fehlersuche

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

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Research

JoVE Journal

Biology

50.7K Aufrufe.  University of Edinburgh. The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.