Biz sayesinde mali destek için aşağıdaki istiyorum: BBSRC Enstitüsü Stratejik Program Harçlar - CF &amp; TMW; BBSRC Doğu Bio DTP finansman - LG; Edinburgh Darwin Güven - MLH. Biz de bu metinde TREM2 optimizasyonu eklemek için izin Dr. Barry MCCOLL teşekkür etmek istiyorum.

<ol>
	<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Protocols on CD-ROM. , (1998).</li><li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblotting+and+immunodetection.">Immunoblotting and immunodetection.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10 (2008).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PLoS One. 8 (8), 72457 (2013).</li><li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+Western+blots.">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots.</a> Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).</li><li>Colella, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Zellner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples.">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).</li><li>Kielar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+axonal+and+synaptic+pathology+in+mouse+models+of+Batten+disease.">Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease.</a> Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).</li><li>Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+proteomics+identifies+Calreticulin+and+GRP75/Mortalin+as+peripherally+accessible+protein+biomarkers+for+spinal+muscular+atrophy.">Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy.</a> Genome Med. 5 (10), 95 (2013).</li><li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+ubiquitin+homeostasis+and+&#946;-catenin+signaling+promote+spinal+muscular+atrophy.">Dysregulation of ubiquitin homeostasis and &#946;-catenin signaling promote spinal muscular atrophy.</a> J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 .</li><li>Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+systems+for+westerns:+chemiluminescence+vs.+infrared+detection.">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li><li>Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GalR1,+but+not+GalR2+or+GalR3,+levels+are+regulated+by+galanin+signalling+in+the+locus+coeruleus+through+a+cyclic+AMP-dependent+mechanism.">GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism.</a> J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).</li><li>Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+signaling+events+in+Drosophila+S2+cells.">Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells.</a> Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).</li><li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+proteomics+analysis+of+synaptic+proteins+identifies+potential+cellular+targets+and+protein+mediators+of+synaptic+neuroprotection+conferred+by+the+slow+Wallerian+degeneration+(Wlds)+gene.">Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+western+blot+analysis.">The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis.</a> J. Vis. Exp. (84), 51149 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Nedeniyle göz ve planlama, herhangi bir deney öncesinde esastır ve sonuçta kullanılan tekniğin başarısını belirlemek olabilir. Uygun antikorlar, transfer ve görüntüleme yöntemleri kullanmayı tercih çalışırken potansiyel engellerden bir bolluk sunabilir WB kullanarak protein algılama gelişmeler. Neyse ki, protein varlığı ve örnekler arasındaki giderek ince anlatım farklılıkları belirlemek için rutin olarak kullanılabileceği QFWB dikkatli bir kontrol listesi ve uygun kontrol önlemleri kullanarak. Bu protokol önlemek ve / veya onunla ilişkili birçok ortak tuzaklar bazılarının üstesinden gelmek için floresan nicel batı lekeleme yanı sıra birkaç sorun giderme stratejileri kapsamlı bir kılavuz sağlar. Duyarlılığı korumak ve elde etmek için kullanılan kritik adımlar gerçekten ölçülebilir ve karşılaştırılabilir ölçümler şunlardır: doku örneklerinden 1) sağlam protein izolasyonu; 2) numune hazırlama; 3) doğru bir proteini loading toplam protein analizi ile belirlendi; Ben-Blot kullanarak proteinlerin 4) Optimal transfer; Bir termal görüşleri ve ilgili yazılım kullanılarak,% 0.1 Tween20 içeren bloke edici tampon içinde birincil ve ikincil antikorlar 5) hazırlanması, ve 6) doğru görselleştirme ve analiz. Kızılötesi floresan algılama gerçekten kantitatif ve daha geleneksel ECL algılama tekniklerle 3,11 ile karşılaştırıldığında daha fazla hassasiyet sağlar. Bu algılama sistemi çok yüzlü olan ve bu nedenle QFWB sınırlı değildir. Bu sistem, tam doku bölümleri 12 görselleştirme ve sayılmasına olanak tanıyan düşük güçte immünohistolojik etiketleme görüntüleme yeteneğine sahiptir. Bu nicel değerlendirme açısından geleneksel mikroskopları ile geleneksel immunofloresan yakalayan rakip kadar kırmızı görüntüleme görebiliyordu çözünürlük açısından gelecekteki potansiyel gelişim bir alandır. Bununla birlikte, p içerisindeki hafif değişiklikler, daha büyük hassasiyet ileminimum ve kontrol önlemlerine tutulur ifade bu çeşitliliği sağlamak açısından önemli olduğunu rotein sağlam protokolleri ile sıkıdır. Bu örnek yükleme düzgün, algılama gerçek ve ilgili üreticinin kullanım kılavuzu test aktarmak için olup olmadığını belirlemek için, birincil ve ikincil antikorlar optimizasyonu olduğu güvence sağlamak için toplam protein lekeli jellerin üretimi ve ardından bu doku örneğinin titiz protein ekstre etme ile başlar Zaman verimli protein transferini elde etmek. Yine de, WB koşulları optimize edilmiş bile, hala sorunlar tam burada keşfedilmiş olmayabilir western&#39;lerine çalışan ile orada ilişkili olabilir. Bunlara aşağıdakiler dahildir fakat Protein çözünmüş ve ekstraksiyon tamponu seçimi dahil çeşitli faktörlere bunlarla sınırlı değildir. Bazı tampon protein konsantrasyonu deneyleri engelleyebilir ve bazı dokular gibi otomatik MACERA kullanılması gibi daha sağlam teknikler gerektiren, çözünür hale getirmek için özellikle zordurting böyle bir Mac&#39;ler dissociator ile birlikte M tüpler gibi kapları kapalı. Buna ek olarak, -80 ° C&#39;de ayıklanır ve non-çıkartılan malzemenin depolanması için basit kontrol tedbirleri hemen çekimi sonrası optimum etiketleme elde edilmesi ve kötü sonuç hafta sonra olması arasında fark olabilir. Modern QFWB yöntemleri protein ifadesindeki ince farklılıkları yakalamak için daha duyarlı olduğu kanıtlanmış ve bu ECL gibi eski tekniklere göre daha çok yönlü eşzamanlı ikili etiketleme 3 izin veriyoruz. Bu batı lekeleme protokolleri sağlam ve doğru ölçümü ve istatistiksel analiz için kolayca tekrarlanabilir olmaları önemlidir. Bu protokol, farklı doku örneklerinin ve türler 3 çeşitli boyunca proteinlerinin tespiti için rutin olarak kullanılacak yeterince hassas ve sağlamdır ve bu nedenle deney 1 &#39;deki sarf malzemesi kullanımını hem de süresini azaltmak, aynı QFWB içinde düşük ve yüksek bolluk proteinlerin ölçülmesine olanak sağlar. 9,14 Ancak hassasiyeti bu şekilde hatalı veri toplama kaçınarak uyulması gereken önemli ve uygun kontrol önlemlerinin dahil edilmesi omic çalışmaları - 1 Buna ek olarak, bu tekniğin artan duyarlılık giderek popüler doğrulama sağlar.

Western blot analizi (DB), orijinal olarak bir doku homojenatı 1 gibi, karmaşık bir biyolojik numunede ilgi konusu bir proteinin varlığını veya yokluğunu belirlemek için, 1970&#39;lerin geliştirilen bir analiz tekniğidir. Yaygın nedeniyle önemli antikor-antijen etkileşimi, protein immunoblot olarak anılacaktır, bu yöntemin 5 ayrı adımlardan oluşur: izoelektrik alanına göre proteinlerin 1) elektroforez yolu ile ayrılması; 2) nitroselüloz veya Polivinil difluoride (PVDF) membran transfer; 3), ilgi konusu proteine ​​özel bir birincil antikor ile etiketlenmesi; Birincil antikora karşı yönlendirilmiş bir ikincil antikorla 4) inkübasyon; ve 5) görselleştirme. Görselleştirme metodoloji güvenliği ve duyarlılığı artırmak için zamanla gelişti. İlk Kitaplarına bazıları, daha sonra daha yaygın olarak kullanılan chemilluminescent (ECL) metodları, kolorimetrik ve ilerlemiş radyo-etiketli etiketler kullanılarak gerçekleştirildi. Radioactivikolorimetrik ve ECL metodolojiler örneğin alkalin fosfataz ya da streptavidin-yaban turpu peroksidaz (HRP) 2 gibi bir enzim haberci ile dolaylı bir etiketleme tekniğini kullanırlar Ty doğrudan belirli bir antijen için problar üzerine etiketlendi. Chromagen ya da lüminesan ürünün etiketlenmesi yoğunluğu güçlü ya da zayıf bir sinyal gücü, örnek olarak, ilgi konusu proteinin daha fazla veya daha az varlığını belirtir, burada densitometrisi kullanılarak ölçülür. ECL daha hassas ve bu nedenle tercih edilen yöntem 2, ancak 3 yöntemleri ilk olarak daha sonra 3 Kurulan daha gelişmiş bir dijital görüntüleme teknikleri ile X-ışını filmi üzerinde geliştirilmiştir. WB dijital görüntüleme ilerlemesi sadece kendi ilgi proteinin varlığını veya yokluğunu belirlemek için, bir araştırmacı izin verilir, ancak başka numuneler karşı karşılaştırıldığında, aynı zamanda seçilmiş bir protein ekspresyon düzeyi için çıkarsama bırakıldı ve bu yüzden şu şekilde de ifade edilebilir &quot;Yarı-kantitatif &amp; #8221 ;. Ölçülen floresan seviyesinin doğrudan numune içindeki miktarı ve tek bir proteinin ekspresyonu ile ilgilidir, burada en son, gerçek bir nicel ve daha hassas Batı lekeleme tekniği geliştirilmiştir: nicel (QFWB) batı beneklemesinden floresan değildir. ECL etiketi ile QFWB karşılaştırıldığı zaman, bir fluorescent sekonder antikor kullanımı doğrusal tespit profili 4 oluşturur. Bu sinyal doğrusallık, genellikle her yerde ifade hazırlık geninin 5,6 ile örneğin, doğrudan protein ifadesi ile ilgili olan 5 ug ve sinyal doygunluk altında düşük protein yükleri ile oluşur ECL tekniklerine tersidir. Bu dengesizlik, muhtemelen potansiyel bir sinyal doyma daha yüksek bir olasılıkla edilen biyotinlenmiş sekonder bağlamak için bir avidin ECL alt-tabaka için müsait bağlanma mevkilerinin daha fazla sayıda neden olur. Bu gibi onl bahsedilerek ECL baz immünolekeleme için ana nedenlerinden biridiry &quot;yarı-kantitatif&quot; 7. Ekspresyon düzeylerinde ince farkları ölçmek ve doğru ölçümlerine neden zaman sinyalinin doyma noktası önem taşımaktadır. Son yıllarda giderek artan duyarlılık ve ince ifade farklılıklarının belirlenmesini detaylandırma yaygın proteomik tekniklerin gelişiyle doğrulama deneyleri 8,9 için gerçekten kantitatif batı lekeleme üzerinde gittikçe artan bir güven sonuçlandı. , Hassas, sağlam ve gerçekten kantitatif metodoloji uygulanması çok önemlidir. Pek çok &quot;optimize&quot; batı lekeleme metodolojileri nedeniyle sık sık resmi belgelenmiş protokollerde belirgin olmayabilir ince metodolojik ayarlamalar kurmak veya taklit edilmesi zor kanıtlamak bağımsız laboratuarlar tarafından kullanılmıştır. Bu QFWB için kurulan ve sağlam bir protokoldür ve ayrıca ortak sorunları tha gidermek için değerli stratejiler sunart uygulanması sırasında ortaya çıkabilir. Bu protokol başlangıçta murin beyin homojenatlarının ile kullanım için optimize edilmiş, ancak bu yana doku örnekleri ve türlerin 4,9,10 geniş bir dizi etkili kullanılmıştır. Belirli sorunların giderilmesi için gerekli potansiyel protokol varyasyonları dahildir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:427px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10230544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">M Tubes</td>
			<td style="width:255px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:427px;">iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>IB401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5602</td>
			<td>Use in gel 1 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">SeeBlue Pre-stained protein standard</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5625&#160;</td>
			<td>Use in gel 2 Total protein stained gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAge LDS Sample buffer 4X</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Micro BCA, Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10249133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Odyssey&#160; blocking buffer</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td>P/N 927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">ODYSSEY CL Infra-red imager</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Call for quotation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">iBlot 7-Minute Blotting System</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This model is no longer in production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">InstantBlue Protein stain</td>
			<td style="width:255px;">Expedeon, UK</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Revitablot western blot stripping buffer&#160;</td>
			<td>Rockland Immunochemicals Inc.</td>
			<td>MB-085-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies

1970&#39;lerin western blot, varlığını ve karmaşık biyolojik örneklerin içindeki belirli proteinlerin göreceli bolluk değerlendirmek için bir tekniğin ilk halka bildirdi kullanımı gördüm. O zamandan beri, batı lekeleme metodoloji moleküler biyologlar deneysel repertuarı ortak bir bileşeni haline gelmiştir. Terimini &quot;western blot&quot; kullanırken PubMed&#39;e üstünkörü bir arama 220.000 yayınlanan yazılarda aşan önemlisi 2014 yılına kadar bu tekniğin kullanımını yapmış önerir, son on yıl kalkınma ile birleştiğinde teknik görüntüleme gelişmeler gördük daha iyi bir duyarlılıktır ve doğrusal algılama daha büyük aralıkları vermiştir duyarlı floresan etiketler. Sonuç biyologlar her zamankinden daha fazla hassasiyet ve doğruluk ile karşılaştırmalı ifade analizi yürütmek için izin verir Western Blot (QFWB) tabanlı bir şimdi gerçekten Ölçülebilir Floresans. Pek çok &quot;optimize&quot; batı lekelememetodolojileri vardır ve farklı laboratuarlarda kullanılmaktadır. Bunlar genellikle nedeniyle ince ama belgesiz usul değişikliklerinin ihtiyacına uygulamak zordur kanıtlamak. Bu protokol giderme stratejileri ile tam bir kurulan ve sağlam QFWB yönteminin açıklayıcı bir tarifini sağlar.

QFWB duyarlılık ve algılama doğrusal aralığı geleneksel ECL algılama daha büyük olduğu, dolayısıyla etkili yorumuyla yardım doğru veri toplanması sağlamak için önemli olan kontrol tedbirleri, bir dizi vardır. İlk olarak, pozitif kontrol numunelerinin dahil Şekil 1 &#39;de gösterildiği gibi. İkinci olarak, transfer optimizasyonu membrana jelden yüksek ve düşük moleküler ağırlıklı proteinlerin denk hareketini garanti altına almak için, Şekil 2&#39;de sergilenen. Üçüncü olarak, antikor optimizasyonu, özellikle orta kimin optimizasyonu genellikle gözden kaçan, ancak antikorlar ilgi protein (ler) doğru yorumlanması ile müdahale edebilen bantlama non-spesifik üretebilir. Şekil 3&#39;e bakın. Dördüncüsü, o da olabilir davayı bir protein saptanamayan görünür ama mevcut olması bekleniyor zaman, bu da sadece ikincil Rais kullanılarak düzeltilebilir ikincil antikor sorunu olabilir kifarklı bir tür konak ed. Şekil 4&#39;e bakınız. Beşinci olarak, toplam protein etiketleme ve analizi her yerde bulunan bir dahili referans standartları 3 olarak ifade edilmiştir geleneksel tek protein (ler) in kullanımı ile karşılaştırıldığında, çok daha sağlam ve ölçülebilir bir yöntemdir. Bu tür tek proteinlerin bir çok farklı şekilde, nörodejeneratif hastalıkların model yanı sıra arasında farklı doku örneklerinin ifade edildiği tespit edilmiştir ve ifade homojenliği, aynı doku 3 olan değiştirilebilir. Standart hata göstermek için karşılaştıran ve her numune karşı ölçülen, çeşitli molekül ağırlıkları aralıkları, her bir şeritte protein yükü miktarının bir toplam protein analizi ile birlikte, Şekil 6&#39;da gösterildiği gibi, Bu nedenle, yükleme kontrol jel üretim örneği yükün homojen teyit edecektir . Önemlisi, bu sorun giderme teknikleri ve tüm denetimleri sadece analiz t duyarlılığı ve tutarlılığı kadar etkilidiroperatör (Şekil 5) tarafından uygulanan ools. Son olarak, bu teknik, soyma ve bağlı faktörler de dahil olmak üzere, ancak, uzun süreli depolama koşulları altında artan bir hassasiyet, azaltılmış arka plan, iki renkli algılama ve zar stabilitesi bunlarla sınırlı olmamak üzere, ECL daha fazla esneklik membran yeniden sondalama için çok uygundur. Şekil 7 bakınız.

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies at JoVE.com

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Sorun Giderme Stratejileri Modern Kantitatif Floresan Western Blot A Guide

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

a-guide-to-modern-quantitative-fluorescent-western-blotting-with

Research

JoVE Journal

Biology

50.7K Görüntüleme.  University of Edinburgh. The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.