Vorremmo ringrazia per il sostegno finanziario: BBSRC Istituto strategico Programma di finanziamento - CF &amp; TMW; Finanziamento BBSRC Oriente Bio DTP - LG; Il Darwin fiducia di Edimburgo - MLH. Vorremmo anche ringraziare il dottor Barry McColl il permesso di includere l&#39;ottimizzazione TREM2 in questo manoscritto.

<ol>
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A., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+signaling+events+in+Drosophila+S2+cells.">Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells.</a> Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).</li><li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+proteomics+analysis+of+synaptic+proteins+identifies+potential+cellular+targets+and+protein+mediators+of+synaptic+neuroprotection+conferred+by+the+slow+Wallerian+degeneration+(Wlds)+gene.">Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).</li><li>Silva, J. 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The authors have nothing to disclose.

Adeguata considerazione e pianificazione è essenziale prima di ogni esperimento e possono infine determinare il successo della tecnica utilizzata. I progressi nella rilevazione della proteina utilizzando WB può presentare una pletora di potenziali ostacoli quando si cerca di scegliere gli anticorpi del caso, di trasferimento e visualizzazione metodi da utilizzare. Per fortuna, con una lista di controllo attento e misure di controllo adeguate QFWB può essere utilizzato di routine per determinare la presenza di proteine ​​e differenze sempre più sottili di espressione tra i campioni. Questo protocollo fornisce una guida completa a fluorescenza western blotting quantitativi così come un paio di strategie di risoluzione dei problemi al fine di evitare e / o superare alcuni dei molti problemi comuni ad esso associati. Le fasi critiche impiegate per mantenere la sensibilità ed ottenere veramente misurazioni quantificabili e comparabili includono: 1) estrazione delle proteine ​​robusta da campioni di tessuto; 2) preparazione del campione; 3) accurata loadin proteineg determinata mediante analisi di proteine ​​totali; 4) trasferimento ottimale di proteine ​​che utilizzano I-Blot; 5) preparazione di anticorpi primari e secondari in tampone di bloccaggio contenente 0,1% Tween20 e 6) corretta visualizzazione e l&#39;analisi utilizzando una termocamera a raggi infrarossi e il software associato. Rilevamento a fluorescenza a raggi infrarossi è veramente quantitativa e fornisce una maggiore sensibilità rispetto alle più tradizionali tecniche di rilevazione ECL 3,11. Questo sistema di rilevamento è multi sfaccettato, e come tale non è limitato a QFWB. Questo sistema è in grado di generare immagini di etichettatura immunoistologico a bassa potenza consentendo la visualizzazione e la quantificazione delle intere sezioni di tessuto 12. Questa è una zona di sviluppo potenziale futuro in termini di risoluzione che potrebbe vedere immagini molto rosso rivaleggiare cattura immunofluorescenza convenzionale con microscopi convenzionali in termini di valutazione quantitativa. Tuttavia, con una maggiore sensibilità ai cambiamenti sottili protein espressione è fondamentale per garantire la variabilità è ridotta al minimo e le misure di controllo sono rigorosi con i protocolli robusti. Questo inizia con l&#39;estrazione delle proteine ​​rigorosa dal campione di tessuto seguita dalla produzione di proteine ​​macchiato totale gel da assicurare che il caricamento del campione è uniforme, l&#39;ottimizzazione di anticorpi primari e secondari al fine di determinare se il rilevamento è reale e testare le linee guida del produttore per quanto riguarda il trasferimento volte per ottenere un efficace trasferimento delle proteine. Tuttavia, anche quando sono ottimizzate le condizioni per WB, ci possono ancora problemi associati alla gestione di western che potrebbero non essere stati completamente esplorati qui. Questi includono ma non sono limitati a fattori tra cui proteine ​​solubilizzazione e la scelta di tampone di estrazione. Alcuni buffer possono interferire con saggi di concentrazione di proteine, e alcuni tessuti sono particolarmente difficili da solubilizzare, richiedono tecniche più robuste come l&#39;uso di macerazione automatizzatoting contenitori sigillati quali tubi M insieme ad un dissociatore Mac. Inoltre, semplici misure di controllo per la conservazione di materiale estratto e non estratti a -80 ° C può essere la differenza tra ottenere etichettatura ottimale subito dopo l&#39;estrazione ed aventi scarsi risultati settimane più tardi. Metodi QFWB moderni hanno dimostrato di essere più sensibile per l&#39;acquisizione di sottili differenze di espressione proteica e sono più versatili permettendo simultanea doppia etichettatura 3 rispetto alle tecniche più vecchi come ECL. E &#39;fondamentale che i protocolli di Western blotting sono robusti e facilmente ripetibile per la quantificazione accurata e l&#39;analisi statistica. Questo protocollo è sensibile e abbastanza robusto per essere usata come metodo per la rilevazione di proteine ​​attraverso una varietà di campioni di tessuto e specie 3 diversi e consente la quantificazione delle proteine ​​poco abbondanti e alti nella stessa QFWB riducendo così l&#39;utilizzo di consumo nonché volta per esperimento 1. 1 Inoltre, la maggiore sensibilità di questa tecnica permette la validazione di sempre più popolare - studi omiche 9,14 tuttavia la precisione è fondamentale e l&#39;inclusione di appropriate misure di controllo devono essere rispettate evitando in tal modo l&#39;acquisizione dei dati errati.

Western blotting (WB) è una tecnica analitica originariamente sviluppato alla fine del 1970 per determinare la presenza o l&#39;assenza di una proteina di interesse in un campione biologico complesso, ad esempio un tessuto omogenato 1. Comunemente denominato immunoblot proteine, a causa dell&#39;interazione antigene-anticorpo chiave, la metodologia consiste di 5 fasi distinte: 1) separazione elettroforetica delle proteine ​​da loro punto isoelettrico; 2) trasferimento ad un nitrocellulosa o di polivinilidene (PVDF) membrana; 3) etichettatura utilizzando un anticorpo primario specifico per la proteina di interesse; 4) incubazione con un anticorpo secondario diretto contro l&#39;anticorpo primario; e 5) visualizzazione. Metodologia di visualizzazione si è evoluto nel tempo per migliorare la sicurezza e la sensibilità. Alcuni dei primi WB sono state effettuate utilizzando radiofoniche tag etichettati che poi progredita al chemilluminescent più diffuso (ECL) metodi colorimetrici e poi. Radioactivity è stato marcato direttamente su sonde di antigeni specifici, mentre metodologie colorimetriche e ECL utilizzano una tecnica di marcatura indiretto con un giornalista di enzimi come la fosfatasi alcalina o perossidasi streptavidina rafano (HRP) 2. L&#39;intensità di etichettatura del prodotto cromogeno o luminescente è misurata utilizzando densitometria per cui la potenza del segnale, forte o debole, indica più o meno la presenza della proteina di interesse nel campione. ECL è il più sensibile e quindi favorita la metodologia 2, ma tutti e 3 i metodi sono stati inizialmente sviluppati in un film x-ray con più sofisticate tecniche di imaging digitale successivamente stabiliti 3. L&#39;avanzamento di imaging digitale di WB consentito non solo un ricercatore per determinare la presenza o l&#39;assenza della loro proteina di interesse, ma anche consentito una deduzione al livello di espressione di una proteina selezionata quando confrontato con altri campioni e quindi può essere indicato come &quot;semi-quantitativa &amp; #8221 ;. Recentemente, una tecnologia western blotting veramente quantitativa e più sensibile è stato sviluppato per cui il livello di fluorescenza misurata è direttamente proporzionale alla quantità e l&#39;espressione di una singola proteina all&#39;interno di un campione: quantitativa fluorescente Western blotting (QFWB). Confrontando QFWB all&#39;etichettatura ECL, l&#39;utilizzo di un anticorpo secondario fluorescente genera un profilo rivelazione lineare 4. Questo è in contrasto con le tecniche ECL, dove la linearità del segnale si verifica in genere con un sacco di proteine ​​basse inferiori a 5 mg e la saturazione del segnale direttamente legati alla espressione della proteina, cioè, con geni housekeeping ubiquitariamente espressi 5,6. Questa disparità è probabilmente causato da un maggior numero di siti di legame disponibili per un substrato avidina ECL lega ad uno secondario biotinilato, risultando in una maggiore probabilità di potenziale saturazione del segnale. Questo è uno dei motivi principali per ECL base di immunoblotting essere indicato come only &quot;semi-quantitativa&quot; 7. Il punto di saturazione del segnale è di fondamentale importanza quando si misura sottili differenze nei livelli di espressione e può portare a misurazioni imprecise. Negli ultimi anni l&#39;avvento di diffuse tecniche di proteomica in dettaglio sempre maggiore sensibilità e l&#39;identificazione dei differenziali di espressione sottili ha comportato un ricorso sempre maggiore a western blotting veramente quantitativo per esperimenti di validazione 8,9. L&#39;applicazione della metodologia sensibile, robusto e veramente quantitativa è quindi cruciale. Molte metodologie di Western blotting &quot;ottimizzate&quot; sono stati utilizzati da laboratori indipendenti, che spesso risultano difficili da creare o replicare a causa di lievi modifiche metodologiche che potrebbero non essere evidenti nei protocolli formali documentate. Si tratta di un protocollo stabilito e robusto per QFWB e inoltre fornisce preziose strategie per la risoluzione dei problemi comuni that possono sorgere in fase di attuazione. Questo protocollo è stato originariamente ottimizzato per l&#39;utilizzo con omogenati di cervello di topo, ma da allora è stato effettivamente utilizzato in una vasta gamma di campioni di tessuto e specie 4,9,10. Variazioni di protocollo potenziali necessari per risolvere i problemi specifici sono inclusi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:427px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10230544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">M Tubes</td>
			<td style="width:255px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:427px;">iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>IB401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5602</td>
			<td>Use in gel 1 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">SeeBlue Pre-stained protein standard</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5625&#160;</td>
			<td>Use in gel 2 Total protein stained gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAge LDS Sample buffer 4X</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Micro BCA, Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10249133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Odyssey&#160; blocking buffer</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td>P/N 927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">ODYSSEY CL Infra-red imager</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Call for quotation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">iBlot 7-Minute Blotting System</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This model is no longer in production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">InstantBlue Protein stain</td>
			<td style="width:255px;">Expedeon, UK</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Revitablot western blot stripping buffer&#160;</td>
			<td>Rockland Immunochemicals Inc.</td>
			<td>MB-085-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies

Fine del 1970 ha visto il primo uso segnalata pubblicamente del Western Blot, una tecnica per valutare la presenza e l&#39;abbondanza relativa di proteine ​​specifiche all&#39;interno di campioni biologici complessi. Da allora, la metodologia western blotting è diventata una componente comune dei biologi molecolari repertorio sperimentale. Una ricerca sommaria di PubMed usando il termine &quot;Western Blot&quot; suggerisce che in eccesso di 220.000 manoscritti pubblicati hanno fatto uso di questa tecnica per l&#39;anno 2014. È importante sottolineare che, negli ultimi dieci anni hanno visto progressi di imaging tecnici accoppiati con lo sviluppo etichette fluorescenti di sensibili che hanno migliorato la sensibilità e diedero ancora più gamme di rilevamento lineare. Il risultato è una fluorescenza ora veramente quantificabile basato Western Blot (QFWB) che permette ai biologi di effettuare analisi di espressione comparativa con maggiore sensibilità e precisione rispetto al passato. Molti &quot;ottimizzato&quot; western blottingesistono metodologie e sono utilizzati in diversi laboratori. Questi spesso risultare difficile a causa della necessità di modifiche procedurali sottili, ma senza documenti. Questo protocollo fornisce una descrizione completa di un metodo QFWB consolidata e robusto, completo di strategie di risoluzione dei problemi.

Come sensibilità QFWB e la gamma lineare di rilevamento è superiore a rilevamento convenzionale ECL, ci sono una serie di misure di controllo che sono fondamentali per garantire che i dati accurati vengono raccolti, favorendo in tal modo l&#39;interpretazione efficace. In primo luogo, l&#39;inclusione di campioni di controllo positivi come mostrato in Figura 1. In secondo luogo, l&#39;ottimizzazione di trasferimento per garantire circolazione equivalenti di proteine ​​alto e basso peso molecolare dal gel alla membrana come mostrato in Figura 2. In terzo luogo, l&#39;ottimizzazione di anticorpi, in particolare secondaria anticorpi la cui ottimizzazione è spesso trascurato, ma che può produrre non specifico banding in grado di interferire con la corretta interpretazione di proteine ​​(s) di interesse. Vedere Figura 3. In quarto luogo, esso può anche essere il caso che, quando una proteina appare rilevabile ma dovrebbe essere presente, questo può anche essere un problema di anticorpo secondario che può essere corretta tramite una semplice rais secondaricato in un ospite di specie diversa. Vedere Figura 4. In quinto luogo, l&#39;etichettatura proteine ​​totali e l&#39;analisi è un metodo molto più robusto e quantificabile in confronto all&#39;uso di proteine ​​singola tradizionale (s) che sono ubiquitariamente espresso per gli standard di riferimento interno 3. Molte di queste singole proteine ​​sono stati trovati per essere espressi in modo differenziale in modelli di malattie neurodegenerative e tra campioni di tessuto differenti e l&#39;uniformità di espressione può variare all&#39;interno dello stesso tessuto 3. Pertanto, la produzione di un gel di controllo carico confermerà l&#39;uniformità del carico del campione quando combinato con un&#39;analisi proteine ​​totali confrontando e quantificare il carico di proteine ​​in ogni corsia a vari intervalli di pesi molecolari misurati contro ogni campione per indicare errore standard come mostrato in figura 6 . È importante sottolineare che tutte queste tecniche e controlli risoluzione dei problemi sono solo efficace come la sensibilità e coerenza dell&#39;analisi tools applicati dal gestore (Figura 5). Infine questa tecnica si presta a stripping e ri-probing delle membrane con maggiore flessibilità rispetto ECL causa di fattori tra cui, ma non limitato ad una maggiore sensibilità, ridotta sfondo, rilevamento doppio colore e stabilità della membrana in condizioni di stoccaggio a lungo termine. Vedere la Figura 7.

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A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Una guida al moderno Quantitative Fluorescent Western Blotting con strategie di risoluzione dei problemi

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

a-guide-to-modern-quantitative-fluorescent-western-blotting-with

Research

JoVE Journal

Biology

50.7K Views.  University of Edinburgh. The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.