نود أن يشكر التالية للحصول على الدعم المالي: معهد BBSRC تمويل البرامج الإستراتيجية - CF &amp; TMW. التمويل BBSRC الشرق بيو DTP - LG. داروين الثقة ادنبره - MLH. نود أيضا أن نشكر الدكتور باري مكول للحصول على إذن لتشمل التحسين TREM2 في هذه المخطوطة.

<ol>
	<li>Towbin, H., Staehelin, T., Gordon, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+transfer+of+proteins+from+polyacrylamide+gels+to+nitrocellulose+sheets:+procedure+and+some+applications.">Electrophoretic transfer of proteins from polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications.</a> Biotechnology. 1992 (24), 145-149 (1979).</li><li>Walker, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Protein Protocols on CD-ROM. , (1998).</li><li>Gallagher, S., Winston, S. E., Fuller, S. A., Hurrell, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoblotting+and+immunodetection.">Immunoblotting and immunodetection.</a> Curr Protoc Mol Biol. Chapter. 10, 10 (2008).</li><li>Eaton, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Total+protein+analysis+as+a+reliable+loading+control+for+quantitative+fluorescent+Western+blotting.">Total protein analysis as a reliable loading control for quantitative fluorescent Western blotting.</a> PLoS One. 8 (8), 72457 (2013).</li><li>Suzuki, O., Koura, M., Noguchi, Y., Uchio-Yamada, K., Matsuda, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Use+of+sample+mixtures+for+standard+curve+creation+in+quantitative+Western+blots.">Use of sample mixtures for standard curve creation in quantitative Western blots.</a> Exp. Anim. 60, 193-196 (2011).</li><li>Colella, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Stain-Free+gels+with+traditional+immunoblot+loading+control+methodology.">Comparison of Stain-Free gels with traditional immunoblot loading control methodology.</a> Anal Biochem. 430 (2), 108-110 (2012).</li><li>Zellner, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-based+Western+blotting+for+quantitation+of+protein+biomarkers+in+clinical+samples.">Fluorescence-based Western blotting for quantitation of protein biomarkers in clinical samples.</a> Electrophoresis. 29, 3621-3627 (2008).</li><li>Kielar, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+correlates+of+axonal+and+synaptic+pathology+in+mouse+models+of+Batten+disease.">Molecular correlates of axonal and synaptic pathology in mouse models of Batten disease.</a> Hum Mol Genet. 18, 4066-4080 (2009).</li><li>Mutsaers, C. A., Lamont, D. J., Hunter, G., Wishart, T. M., Gillingwater, T. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+proteomics+identifies+Calreticulin+and+GRP75/Mortalin+as+peripherally+accessible+protein+biomarkers+for+spinal+muscular+atrophy.">Label-free proteomics identifies Calreticulin and GRP75/Mortalin as peripherally accessible protein biomarkers for spinal muscular atrophy.</a> Genome Med. 5 (10), 95 (2013).</li><li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dysregulation+of+ubiquitin+homeostasis+and+&#946;-catenin+signaling+promote+spinal+muscular+atrophy.">Dysregulation of ubiquitin homeostasis and &#946;-catenin signaling promote spinal muscular atrophy.</a> J Clin Invest. 124 (4), 1821-1834 .</li><li>Mathews, S. T., Plaisance, E. P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+systems+for+westerns:+chemiluminescence+vs.+infrared+detection.">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li><li>Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GalR1,+but+not+GalR2+or+GalR3,+levels+are+regulated+by+galanin+signalling+in+the+locus+coeruleus+through+a+cyclic+AMP-dependent+mechanism.">GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism.</a> J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).</li><li>Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+signaling+events+in+Drosophila+S2+cells.">Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells.</a> Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).</li><li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+proteomics+analysis+of+synaptic+proteins+identifies+potential+cellular+targets+and+protein+mediators+of+synaptic+neuroprotection+conferred+by+the+slow+Wallerian+degeneration+(Wlds)+gene.">Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+western+blot+analysis.">The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis.</a> J. Vis. Exp. (84), 51149 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

الاعتبار الواجب والتخطيط أمر ضروري قبل أي التجربة ويمكن تحديد نهاية المطاف نجاح التقنية المستخدمة. التقدم في الكشف عن البروتين باستخدام WB يمكن تقديم مجموعة كبيرة من العقبات المحتملة عند محاولة اختيار الأجسام المضادة، ونقل التصور والطرق المناسبة للاستخدام. لحسن الحظ، وذلك باستخدام قائمة مراجعة متأنية وتدابير الرقابة المناسبة QFWB يمكن استخدامها بشكل روتيني لتحديد وجود البروتين والخلافات التعبير خفية متزايد بين العينات. وينص هذا البروتوكول دليل شامل لالفلورسنت النشاف الغربي الكمي فضلا عن عدد قليل من الاستراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها لتجنب و / أو التغلب على بعض من كثير من المزالق الشائعة المرتبطة به. الخطوات الحاسمة المستخدمة للحفاظ على حساسية والحصول حقا وتشمل قياسات قابلة للقياس وقابلة للمقارنة: 1) قوي استخراج البروتين من عينات الأنسجة. 2) إعداد العينة؛ 3) دقيقة البروتين من التحميلز يحددها الكلي تحليل البروتين. 4) نقل الأمثل للبروتينات باستخدام I-البقعة. 5) إعداد الأجسام المضادة الأولية والثانوية في عرقلة العازلة التي تحتوي على 0.1٪ Tween20، و6) التصور الصحيح والتحليل باستخدام الأشعة تحت الحمراء تصوير والبرامج المرتبطة بها. الكشف الفلوري بالأشعة تحت الحمراء هو حقا الكمي ويوفر حساسية أكبر مقارنة مع المزيد من التقنيات التقليدية كشف ECL 3،11. هذا النظام هو الكشف متعدد الأوجه، وعلى هذا النحو لا يقتصر على QFWB. هذا النظام قادر على التصوير من العلامات immunohistological في الطاقة المنخفضة مما يسمح التصور النوعي والكمي لأقسام الأنسجة كلها 12. وهذا هو المجال الوحيد للتنمية المستقبلية المحتملة من حيث القرار الذي يمكن أن نرى التصوير الحمراء بعيدة ينافس اسر المناعي التقليدي مع المجاهر التقليدية من حيث التقييم الكمي. ومع ذلك، مع حساسية أكبر للتغيرات الطفيفة في صrotein التعبير من الأهمية بمكان لضمان تقلب يتم الاحتفاظ بها إلى الحد الأدنى والسيطرة على تدابير صارمة مع بروتوكولات قوية. هذا يبدأ مع الدقيق استخراج البروتينات من عينة الأنسجة تليها إنتاج البروتين الكلي ملطخة المواد الهلامية لتقديم ضمانات بأن عينة التحميل هو الزي الرسمي، والاستفادة المثلى من الأجسام المضادة الأولية والثانوية من أجل تحديد ما إذا كان كشف حقيقي واختبار المبادئ التوجيهية الشركة الصانعة فيما يتعلق بنقل الأوقات للحصول على نقل البروتين الفعال. ومع ذلك، وحتى عندما يتم تحسين شروط البنك الدولي، وهناك قد لا تزال المشاكل المرتبطة بإدارة الغربيين قد لا تم استكشافها بالكامل هنا. وتشمل هذه ولكنها لا تقتصر على العوامل من بينها إذابة البروتين واختيار استخراج العازلة. يمكن لبعض مخازن تتداخل مع المقايسات تركيز البروتين، وبعض الأنسجة من الصعب بشكل خاص للذوبان، والتي تتطلب تقنيات أكثر قوة مثل استخدام macera الآليتينغ حاويات مختومة مثل أنابيب M جنبا إلى جنب مع dissociator أجهزة ماكينتوش. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن للتدابير الرقابة بسيطة لتخزين المواد المستخرجة وغير المستخرجة-في -80 درجة مئوية يكون الفرق بين الحصول على العلامات الأمثل مباشرة بعد استخراج وجود وقت لاحق من النتائج السيئة أسابيع. وأثبتت الأساليب الحديثة QFWB أن تكون أكثر حساسية لالتقاط الفروق الدقيقة في تعبير البروتين ويسمحون أكثر تنوعا في وقت واحد وضع العلامات مزدوج 3 بالمقارنة مع التقنيات القديمة مثل ECL. فمن الأهمية بمكان أن بروتوكولات النشاف الغربية هي قوية وقابلة للتكرار بسهولة لالكمي الدقيق والتحليل الإحصائي. هذا البروتوكول هو حساس وقوي بما فيه الكفاية ليتم استخدامها بشكل روتيني للكشف عن البروتينات عبر مجموعة متنوعة من عينات الأنسجة المختلفة والأنواع 3 و يسمح الكمي للبروتينات وفرة المنخفضة والعالية داخل نفس QFWB بالتالي الحد من استخدام الاستهلاكية فضلا عن الوقت في التجربة 11 وبالإضافة إلى ذلك، فإن زيادة حساسية هذه التقنية تتيح التحقق من شعبية متزايدة - دراسات OMIC 9،14 لكن دقة أمر بالغ الأهمية وإدراج تدابير الرقابة المناسبة يجب الالتزام بها وبالتالي تجنب الحصول على البيانات الخاطئة.

النشاف الغربي (WB) هو تقنية تحليلية وضعت أصلا في أواخر 1970s لتحديد وجود أو عدم وجود بروتين من الفائدة في عينة بيولوجية معقدة، مثل جناسة الأنسجة 1. يشار إلى أن طخة مناعية البروتين، ويرجع ذلك إلى تفاعل الضد مستضد الرئيسي، وتتكون هذه المنهجية من 5 خطوات متميزة: 1) الفصل الكهربي للبروتينات من خلال وجهة نظرهم تساوي الكهربية. 2) نقل إلى النيتروسليلوز أو البولي فينيل difluoride (PVDF) الغشاء. 3) وضع العلامات باستخدام الأجسام المضادة الأولية محددة للبروتين في المصالح؛ 4) الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية الموجهة ضد الأجسام المضادة الأولية. و5) التصور. وقد تطورت منهجية التصور مع الوقت لتحسين السلامة والحساسية. أجريت بعض WBS الأولى من استخدام الإذاعة علامات المسمى الذي تقدمت بعد ذلك إلى chemilluminescent أكثر استخداما (ECL) طرق اللونية ثم. Radioactiviوكان تاي المسمى مباشرة على تحقيقات لمستضدات معينة في حين تستخدم منهجيات اللونية وECL تقنية وضع العلامات غير المباشرة مع مراسل انزيم مثل الفوسفاتيز القلوية الغلوثانيون أو streptavidin الفجل (HRP) 2. يتم قياس شدة العلامات من chromagen أو الانارة المنتج باستخدام كثافة حيث قوة الإشارة، قوية أو ضعيفة، ويشير أكثر أو أقل وجود البروتين من الفائدة في العينة. أطلق بيت التمويل الخليجي هو منهجية أكثر حساسية، وبالتالي يفضل 2 ولكن وضعت جميع الطرق 3 البداية على فيلم الأشعة السينية مع تقنيات التصوير الرقمي أكثر تطورا أنشئت في وقت لاحق 3. النهوض التصوير الرقمي من البنك الدولي يسمح ليس فقط الباحث لتحديد وجود أو عدم وجود بروتين اهتمامهم، ولكن أيضا يسمح الاستنتاج إلى مستوى التعبير عن بروتين المحددة عند مقارنتها عينات أخرى، وبالتالي يمكن أن يشار إلى &quot;شبه كمي &amp; #8221 ؛. مؤخرا، تم تطوير تقنية النشاف الغربية الكمية حقا، وأكثر حساسية حيث مستوى مضان تقاس يرتبط مباشرة لكمية والتعبير عن بروتين واحد ضمن العينة: الكمية الفلورسنت غرب النشاف (QFWB). عند مقارنة QFWB مع وضع العلامات ECL، واستخدام الأجسام المضادة الثانوية فلوري يولد لمحة الكشف الخطي 4. هذا هو على النقيض من تقنيات ECL التي يحدث فيها إشارة خطية عموما مع انخفاض الأحمال البروتين أقل من 5 ميكروغرام وإشارة التشبع علاقة مباشرة البروتين التعبير، أي مع الجينات التدبير المنزلي أعرب بتواجد مطلق 5،6. ومن المرجح أن سبب هذا التفاوت من قبل عدد أكبر من مواقع الربط المتاحة لECL الركيزة أفيدين لربط المعقدة البيروكسيديز الثانوية، مما أدى إلى ارتفاع احتمالات تشبع إشارة محتملة. هذا هو واحد من الأسباب الرئيسية لECL قاعدة immunoblotting إحالتها إلى y ....... قل كماذ &quot;شبه كمي&quot; (7). نقطة التشبع من إشارة ذات أهمية حاسمة عند قياس الاختلافات الطفيفة في مستويات التعبير، ويمكن أن تؤدي إلى قياسات غير دقيقة. في السنوات الأخيرة أدى ظهور تقنيات البروتين على نطاق واسع يفصل متزايدة الحساسية وتحديد الفروق الدقيقة في التعبير عن الاعتماد المتزايد على النشاف الغربي الكمي حقا للتجارب التصديق 8،9. تطبيق منهجية حساسة وقوية والكمية حقا هو بالتالي حاسما. وقد استخدمت العديد من &quot;الأمثل&quot; منهجيات النشاف الغربية من قبل مختبرات مستقلة، والتي يكون من الصعب في كثير من الأحيان إلى إنشاء أو تكرار بسبب التعديلات المنهجية الدقيقة التي قد لا تكون واضحة في بروتوكولات رسمية موثقة. هذا هو بروتوكول الراسخة والقوية لQFWB ويوفر استراتيجيات قيمة لاستكشاف المشاكل الشائعة ثا إضافير قد تنشأ أثناء التنفيذ. تم تحسين هذا البروتوكول في الأصل للاستخدام مع الخليط دماغ الفئران، ولكن منذ ذلك الحين يستخدم بشكل فعال عبر مجموعة واسعة من عينات الأنسجة وأنواع 4،9،10. تدرج التغيرات المحتملة بروتوكول المطلوبة لقضايا محددة استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:427px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10230544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">M Tubes</td>
			<td style="width:255px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:427px;">iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>IB401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5602</td>
			<td>Use in gel 1 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">SeeBlue Pre-stained protein standard</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5625&#160;</td>
			<td>Use in gel 2 Total protein stained gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAge LDS Sample buffer 4X</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Micro BCA, Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10249133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Odyssey&#160; blocking buffer</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td>P/N 927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">ODYSSEY CL Infra-red imager</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Call for quotation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">iBlot 7-Minute Blotting System</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This model is no longer in production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">InstantBlue Protein stain</td>
			<td style="width:255px;">Expedeon, UK</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Revitablot western blot stripping buffer&#160;</td>
			<td>Rockland Immunochemicals Inc.</td>
			<td>MB-085-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies

شهدت أواخر 1970s أول استخدام تقارير علنية للطخة غربية، وهي تقنية لتقييم وجود وفرة نسبية من بروتينات معينة في عينات بيولوجية معقدة. منذ ذلك الحين، أصبحت منهجية النشاف الغربية عنصر مشترك من علماء البيولوجيا الجزيئية ذخيرة تجريبية. بحث سريع للمجلات استخدام مصطلح &quot;طخة غربية&quot; تشير إلى أن ما يزيد على 220،000 المخطوطات المنشورة جعلت استخدام هذه التقنية بحلول عام 2014. والأهم من ذلك، شهدت السنوات العشر الأخيرة تطورات تقنية التصوير إلى جانب تنمية العلامات الفلورية للحساسية التي تحسنت حساسية وأسفرت نطاقات أكبر من الكشف الخطي. والنتيجة هي الآن قابلة للقياس الكمي الإسفار حقا مقرها البقعة الغربية (QFWB) التي تسمح للعلماء الأحياء لإجراء تحليل مقارن التعبير بقدر أكبر من الحساسية ودقة من أي وقت مضى. العديد من &quot;الأمثل&quot; النشاف الغربيوتوجد منهجيات واستخدمت في مختبرات مختلفة. هذه غالبا ما يكون من الصعب تنفيذ ذلك بسبب متطلبات التعديلات الإجرائية الدقيقة ولكنها غير موثقة. وينص هذا البروتوكول على وصف شامل لطريقة QFWB ثابتة وقوية، مع استكمال استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها.

كما QFWB حساسية ومجموعة خطية من كشف أكبر من كشف ECL التقليدي، وهناك عدد من تدابير الرقابة التي تعتبر حاسمة لضمان دقة البيانات التي يتم جمعها، وبالتالي المساعدة على تفسير فعالية. أولا، إدراج عينات مراقبة إيجابية كما هو مبين في الشكل رقم 1. ثانيا، الاستفادة المثلى من نقل لضمان حركة المكافئة للبروتينات عالية ومنخفضة الوزن الجزيئي من الهلام إلى الغشاء كما عرضت في الشكل 2. ثالثا، الاستفادة المثلى من الأجسام المضادة والثانوي خاصة الأجسام المضادة التي الأمثل غالبا ما يتم تجاهله، ولكن التي يمكن أن تنتج غير محددة النطاقات قادرة على التدخل في التفسير الصحيح للبروتين (ق) من الفائدة. انظر الشكل 3. رابعا، قد يكون الحال أيضا أنه عندما يظهر بروتين غير قابل للكشف لكن من المتوقع أن تكون موجودة، وهذا قد يكون أيضا مسألة الأجسام المضادة الثانوية التي يمكن تصحيحها ببساطة عن طريق استخدام الريس الثانويةإد في مجموعة مختلفة الأنواع. انظر الشكل 4. خامسا، وضع العلامات البروتين الكلي والتحليل هي طريقة أكثر قوة بكثير للقياس ومقارنة لاستخدام بروتين واحد التقليدية (ق) التي يتم التعبير بتواجد مطلق للمعايير المرجعية الداخلية 3. تم العثور على العديد من هذه البروتينات واحدة أن أعرب تفاضلي في نماذج من الأمراض العصبية وكذلك بين عينات من الأنسجة المختلفة وتوحيد التعبير يمكن أن يغير داخل نفس النسيج 3. وبالتالي، فإن إنتاج مادة هلامية السيطرة التحميل يجب التأكد من انتظام الحمل عينة عندما جنبا إلى جنب مع تحليل البروتين الكلي من خلال مقارنة وقياس حمولة البروتين في كل حارة في مختلف الأوزان الجزيئية يتراوح قياسها ضد كل عينة لبيان الخطأ المعياري كما هو موضح في الشكل (6) . والأهم من كل هذه التقنيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها وضوابط فعالة مثل الحساسية واتساق التحليل ر فقطools المطبقة من قبل المشغل (الشكل 5). أخيرا هذه التقنية يفسح المجال لتجريد وإعادة التحقيق من الأغشية مع المزيد من المرونة من ECL بسبب عوامل بما في ذلك سبيل المثال لا الحصر زيادة الحساسية، وخفض الخلفية، كشف اللون المزدوج والاستقرار الغشاء تحت ظروف التخزين على المدى الطويل. انظر الشكل 7.

Watch this Scientific Journal Video about A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies at JoVE.com

A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

دليل لمودرن الكمية نيون الغربية التنشيف مع استراتيجيات استكشاف الأخطاء وإصلاحها

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

a-guide-to-modern-quantitative-fluorescent-western-blotting-with

Research

JoVE Journal

Biology

50.7K Views.  University of Edinburgh. The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Video: A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

Western Blotting Using the Invitrogen NuPage Novex Bis Tris MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the relative amount of the protein present in different samples, and analyze the results of co-immunoprecipitation experiments. In this method, a target protein is detected with a specific primary antibody in a given sample of tissue homogenate or extract. Protein separation according to molecular weight is achieved using denaturing SDS-PAGE. After transfer to a membrane, the target protein is probed with a specific primary antibody and detected by chemiluminescence.
Since its first description, the western-blotting technique has undergone several improvements, including pre-cast gels and user-friendly equipment. In our laboratory, we have chosen to use the commercially available NuPAGE electrophoresis system from Invitrogen. It is an innovative neutral pH, discontinuous SDS-PAGE, pre-cast mini-gel system. This system presents several advantages over the traditional Laemmli technique including: i) a longer shelf life of the pre-cast gels ranging from 8 months to 1 year; ii) a broad separation range of molecular weights from 1 to 400 kDa depending of the type of gel used; and iii) greater versatility (range of acrylamide percentage, the type of gel, and the ionic composition of the running buffer).
The procedure described in this video article utilizes the Bis-Tris discontinuous buffer system with 4-12% Bis-Tris gradient gels and MES running buffer, as an illustration of how to perform a western-blot using the Invitrogen NuPAGE electrophoresis system. In our laboratory, we have obtained good and reproducible results for various biochemical applications using this western-blotting method.

This technical article describes a standard western-blotting procedure using the commercially available NuPAGE electrophoresis Mini-Gel system from Invitrogen.

الغربية التنشيف باستخدام NuPage Invitrogen Novex مكرر تريس MiniGels

Western Blotting (or immunoblotting) is a standard laboratory procedure allowing investigators to verify the expression of a protein, determine the ...

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing and adult tissue. An advance in this concept is Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM), linking gene expression, cell fate, and cell behaviors in vivo, to create fate maps based on genetic lineage.
GIFM exploits X-CreER lines where X is a gene or set of gene regulatory elements that confers spatial expression of a modified bacteriophage protein, Cre recombinase (CreERT). CreERT contains a modified estrogen receptor ligand binding domain which renders CreERT sequestered in the cytoplasm in the absence of the drug tamoxifen. The binding of tamoxifen releases CreERT, which translocates to the nucleus and mediates recombination between DNA sequences flanked by loxP sites. In GIFM, recombination typically occurs between a loxP flanked Stop cassette preceding a reporter gene such as GFP.
Mice are bred to contain either a region- or cell type-specific CreER and a conditional reporter allele. Untreated mice will not have marking because the Stop cassette in the reporter prevents further transcription of the reporter gene. We administer tamoxifen by oral gavage to timed-pregnant females, which provides temporal control of CreERT release and subsequent translocation to the nucleus removing the Stop cassette from the reporter. Following recombination, the reporter allele is constitutively and heritably expressed. This series of events marks cells such that their genetic history is indelibly recorded. The recombined reporter thus serves as a high fidelity genetic lineage tracer that, once on, is uncoupled from the gene expression initially used to drive CreERT.
We apply GIFM in mouse to study normal development and ascertain the contribution of genetic lineages to adult cell types and tissues. We also use GIFM to follow cells on mutant genetic backgrounds to better understand complex phenotypes that mimic salient features of human genetic disorders.
This video article guides researchers through experimental methods to successfully apply GIFM. We demonstrate the method using our well characterized Wnt1-CreERT;mGFP mice by administering tamoxifen at embryonic day (E)8.5 via oral gavage followed by dissection at E12.5 and analysis by epifluorescence stereomicroscopy. We also demonstrate how to micro-dissect fate mapped domains for explant preparation or FACS analysis and dissect adult fate-mapped brains for whole mount fluorescent imaging. Collectively, these procedures allow researchers to address critical questions in developmental biology and disease models.

A Practical Approach to Genetic Inducible Fate Mapping: A Visual Guide to Mark and Track Cells In Vivo

Genetic Inducible Fate Mapping (GIFM) marks and tracks cells with fine spatial and temporal control in vivo and elucidates how cells from a specific genetic lineage contribute to developing and adult tissues. Demonstrated here are the techniques required to fate map E12.5 mouse embryos for epifluorescent and explant analysis.

نهج عملي لرسم الخرائط الوراثية محرض مصير : دليل مرئي لمارك وتعقب خلايا في فيفو</em

Fate maps are generated by marking and tracking cells in vivo to determine how progenitors contribute to specific structures and cell types in developing ...

Western Blotting: Sample Preparation to Detection

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel electrophoresis to separate native or denatured proteins by the length of the polypeptide (denaturing conditions) or by the 3-D structure of the protein (native/ non-denaturing conditions). The proteins are then transferred to a membrane (typically nitrocellulose or PVDF), where they are probed (detected) using antibodies specific to the target protein.

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract.

الغربية التنشيف : إعداد نموذج لكشف

Western blotting is an analytical technique used to detect specific proteins in a given sample of tissue homogenate or extract. It uses gel ...

Polymerase Chain Reaction: Basic Protocol Plus Troubleshooting and Optimization Strategies

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of microbiology was transformed with the advent of Anton van Leeuwenhoek&#39;s microscope, which allowed scientists to visualize prokaryotes for the first time. The development of the polymerase chain reaction (PCR) is one of those innovations that changed the course of molecular science with its impact spanning countless subdisciplines in biology. The theoretical process was outlined by Keppe and coworkers in 1971; however, it was another 14 years until the complete PCR procedure was described and experimentally applied by Kary Mullis while at Cetus Corporation in 1985. Automation and refinement of this technique progressed with the introduction of a thermal stable DNA polymerase from the bacterium Thermus aquaticus, consequently the name Taq DNA polymerase.
PCR is a powerful amplification technique that can generate an ample supply of a specific segment of DNA (i.e., an amplicon) from only a small amount of starting material (i.e., DNA template or target sequence). While straightforward and generally trouble-free, there are pitfalls that complicate the reaction producing spurious results. When PCR fails it can lead to many non-specific DNA products of varying sizes that appear as a ladder or smear of bands on agarose gels. Sometimes no products form at all. Another potential problem occurs when mutations are unintentionally introduced in the amplicons, resulting in a heterogeneous population of PCR products. PCR failures can become frustrating unless patience and careful troubleshooting are employed to sort out and solve the problem(s). This protocol outlines the basic principles of PCR, provides a methodology that will result in amplification of most target sequences, and presents strategies for optimizing a reaction. By following this PCR guide, students should be able to: 
 
&#9679; Set up reactions and thermal cycling conditions for a conventional PCR experiment 
&#9679; Understand the function of various reaction components and their overall effect on a PCR experiment 
&#9679; Design and optimize a PCR experiment for any DNA template 
&#9679; Troubleshoot failed PCR experiments

PCR has emerged as a common technique in many molecular biology laboratories. Provided here is a quick guide to several conventional PCR protocols. Because each reaction is a unique experiment, optimal conditions required to generate a product vary. Understanding the variables in a reaction will greatly enhance troubleshooting efficiency, thereby increasing the chance to obtain the desired result.

تفاعل البلمرة سلسلة: البروتوكول الأساسي زائد استراتيجيات حل المشكلات والتحسين

In the biological sciences there have been technological advances that catapult the discipline into golden ages of discovery. For example, the field of ...

V3 Stain-free Workflow for a Practical, Convenient, and Reliable Total Protein Loading Control in Western Blotting

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black box&#34; because an experimentalist does not know if it has been performed successfully until the last of several steps. Moreover, the quality of western blot data is sometimes challenged due to a lack of effective quality control tools in place throughout the western blotting process. Here we describe the V3 western workflow, which applies stain-free technology to address the major concerns associated with the traditional western blot protocol. This workflow allows researchers: 1) to run a gel in about 20-30 min; 2) to visualize sample separation quality within 5 min after the gel run; 3) to transfer proteins in 3-10 min; 4) to verify transfer efficiency quantitatively; and most importantly 5) to validate changes in the level of the protein of interest using total protein loading control. This novel approach eliminates the need of stripping and reprobing the blot for housekeeping proteins such as &#946;-actin, &#946;-tubulin, GAPDH, etc. The V3 stain-free workflow makes the western blot process faster, transparent, more quantitative&#160;and reliable.

V3 workflow is a western blot procedure using stain-free gels. The stain-free technology allows researchers to visualize protein separation quality, to verify the transfer efficiency, and most importantly, to validate the change in the protein of interest using total protein quantification as a reliable loading control.

V3 سير العمل خالية من وصمة عار لمراقبة عملية ومريحة وموثوق بها مجموع البروتين تحميل في النشاف الغربية

The western blot is a very useful and widely adopted lab technique, but its execution is challenging. The workflow is often characterized as a &#34;black ...

A Practical Guide to Phylogenetics for Nonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this topic and so it presents inherent problems. Here we compile a practical introduction to phylogenetics for nonexperts.&#160;We outline in a step-by-step manner, a pipeline for generating reliable phylogenies from gene sequence datasets. We begin with a user-guide for similarity search tools via online interfaces as well as local executables. Next, we explore programs for generating multiple sequence alignments followed by protocols for using software to determine best-fit models of evolution. We then outline protocols for reconstructing phylogenetic relationships via maximum likelihood and Bayesian criteria&#160;and finally describe tools for visualizing phylogenetic trees. While this is not by any means an exhaustive description of phylogenetic approaches, it does provide the reader with practical starting information on key software applications commonly utilized by phylogeneticists. The vision for this article would be that it could serve as a practical training tool for researchers embarking on phylogenetic studies&#160;and also serve as an educational resource that could be incorporated into a classroom or teaching-lab.

Here we describe a step-by-step pipeline for generating reliable phylogenies from nucleotide or amino acid sequence datasets. This guide aims to serve researchers or students new to phylogenetic analysis.&#160;

دليل عملي لPhylogenetics لNonexperts

Many researchers, across incredibly diverse foci, are applying phylogenetics to their research question(s). However, many researchers are new to this ...

The Fastest Western in Town: A Contemporary Twist on the Classic Western Blot Analysis

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of Western blotting has several drawbacks that include low quality resolution, spurious bands, decreased sensitivity, and poor protein integrity. Recent advances have drastically improved numerous aspects of the standard Western blot protocol to produce higher qualitative and quantitative data. The Bis-Tris gel system, an alternative to the conventional Laemmli system, generates better protein separation and resolution, maintains protein integrity, and reduces electrophoresis to a 35 min run time. Moreover, the iBlot dry blotting system, dramatically improves the efficacy and speed of protein transfer to the membrane in 7 min, which is in contrast to the traditional protein transfer methods that are often more inefficient with lengthy transfer times. In combination with these highly innovative modifications, protein detection using infrared fluorescent imaging results in higher-quality, more accurate and consistent data compared to the standard Western blotting technique of chemiluminescence. This technology can simultaneously detect two different antigens on the same membrane by utilizing two-color near-infrared dyes that are visualized in different fluorescent channels. Furthermore, the linearity and broad dynamic range of fluorescent imaging allows for the precise quantification of both strong and weak protein bands. Thus, this protocol describes the key improvements to the classic Western blotting method, in which these advancements significantly increase the quality of data while greatly reducing the performance time of this experiment.

This protocol explores the latest advancements in performing Western blot analyses.&#160;These novel modifications employ a Bis-Tris gel system with a 35&#160;min electrophoresis run time, a 7&#160;min dry blotting transfer system, and infrared fluorescent protein detection and imaging that generates higher resolution, quality, sensitivity, and improved accuracy of Western data.

أسرع الغربية في المدينة: لمسة عصرية على تحليل كلاسيكي غربي وصمة عار

The Western blot techniques that were originally established in the late 1970s are still actively utilized today. However, this traditional method of ...

Floral-Dip Transformation of Flax (Linum usitatissimum) to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be successful for many plant species. However, flax (Linum usitatissimum) transformation by floral-dip has not been reported. The goal of this protocol is to establish that Agrobacterium and the floral-dip method can be used to generate transgenic flax. We show that this technique is simple, inexpensive, efficient, and more importantly, gives a higher transformation rate than the current available methods of flax transformation.
In summary, inflorescences of flax were dipped in a solution of Agrobacterium carrying a binary vector plasmid (T-DNA fragment plus the Linum Insertion Sequence, LIS-1) for 1 - 2 min. The plants were laid flat on their side for 24 hr. Then, plants were maintained under normal growth conditions until the next treatment. The process of dipping was repeated 2 - 3 times, with approximately 10 - 14 day intervals between dipping. The T1 seeds were collected and germinated on soil. After approximately two weeks, treated progenies were tested by direct PCR; 2 - 3 leaves were used per plant plus the appropriate T-DNA primers. Positive transformants were selected and grown to maturity. The transformation rate was unexpectedly high, with 50 - 60% of the seeds from treated plants being positive transformants. This is a higher transformation rate than those reported for Arabidopsis thaliana and other plant species, using floral-dip transformation. It is also the highest, which has been reported so far, for flax transformation using other methods for transformation.

Floral-Dip Transformation of Flax Linum usitatissimum to Generate Transgenic Progenies with a High Transformation Rate

Here, we present a protocol to transform flax using Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip. This protocol is simple to perform and inexpensive, yet yields a higher transformation rate than the current available methods for flax transformation.

الأزهار وتراجع التحول من الكتان (<em&gt; LINUM usitatissimum</em&gt;) لتوليد المعدلة وراثيا السلالات مع معدل التحويل عالية

Agrobacterium-mediated plant transformation via floral-dip is a widely used technique in the field of plant transformation and has been reported to be ...

Genetic Barcoding with Fluorescent Proteins for Multiplexed Applications

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery of fluorescent proteins and their genes have enabled the engineering of protein fusions for localization, the analysis of transcriptional activation and translation of proteins of interest, or the general tracking of individual cells and cell populations. The use of fluorescent protein genes in combination with retroviral technology has further allowed the expression of these proteins in mammalian cells in a stable and reliable manner. Shown here is how one can utilize these genes to give cells within a population of cells their own biosignature. As the biosignature is achieved with retroviral technology, cells are barcoded &#180;indefinitely&#180;. As such, they can be individually tracked within a mixture of barcoded cells and utilized in more complex biological applications. The tracking of distinct populations in a mixture of cells is ideal for multiplexed applications such as discovery of drugs against a multitude of targets or the activation profile of different promoters. The protocol describes how to elegantly develop and amplify barcoded mammalian cells with distinct genetic fluorescent markers, and how to use several markers at once or one marker at different intensities. Finally, the protocol describes how the cells can be further utilized in combination with cell-based assays to increase the power of analysis through multiplexing.

Since the discovery of the green fluorescent protein gene, fluorescent proteins have impacted molecular cell biology. This protocol describes how expression of distinct fluorescent proteins through genetic engineering is used for barcoding individual cells. The procedure enables tracking distinct populations in a cell mixture, which is ideal for multiplexed applications.

المتوازية الوراثية مع نيون البروتينات للتطبيقات المضاعفة

Fluorescent proteins, fluorescent dyes and fluorophores in general have revolutionized the field of molecular cell biology. In particular, the discovery ...

Development of a Quantitative Recombinase Polymerase Amplification Assay with an Internal Positive Control

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to quantify DNA sample concentration using a standard curve. In this manuscript, a detailed protocol for developing and implementing a real-time quantitative recombinase polymerase amplification assay (qRPA assay) is provided. Using HIV-1 DNA quantification as an example, the assembly of real-time RPA reactions, the design of an internal positive control (IPC) sequence, and co-amplification of the IPC and target of interest are all described. Instructions and data processing scripts for the construction of a standard curve using data from multiple experiments are provided, which may be used to predict the concentration of unknown samples or assess the performance of the assay. Finally, an alternative method for collecting real-time fluorescence data with a microscope and a stage heater as a step towards developing a point-of-care qRPA assay is described. The protocol and scripts provided may be used for the development of a qRPA assay for any DNA target of interest.

Provided is a protocol for developing a real-time recombinase polymerase amplification assay to quantify initial concentration of DNA samples using either a thermal cycler or a microscope and stage heater. Also described is the development of an internal positive control. Scripts are provided for processing raw real-time fluorescence data.

تطوير الكمية Recombinase البلمرة التضخيم الفحص مع الرقابة الداخلية إيجابي

It was recently demonstrated that recombinase polymerase amplification (RPA), an isothermal amplification platform for pathogen detection, may be used to ...