Nous tenons à remercier pour le soutien financier qui suit: BBSRC Institut stratégique de financement des programmes - CF &amp; TMW; Financement BBSRC Est Bio DTP - LG; Le Darwin Trust of Edinburgh - MLH. Nous tenons également à remercier le Dr Barry McColl pour permission d&#39;inclure l&#39;optimisation TREM2 dans ce manuscrit.

<ol>
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P., Kim, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+systems+for+westerns:+chemiluminescence+vs.+infrared+detection.">Imaging systems for westerns: chemiluminescence vs. infrared detection.</a> Methods Mol Biol. 536, 499-513 (2009).</li><li>Hawes, J. J., Brunzell, D. H., Wynick, D., Zachariou, V., Picciotto, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GalR1,+but+not+GalR2+or+GalR3,+levels+are+regulated+by+galanin+signalling+in+the+locus+coeruleus+through+a+cyclic+AMP-dependent+mechanism.">GalR1, but not GalR2 or GalR3, levels are regulated by galanin signalling in the locus coeruleus through a cyclic AMP-dependent mechanism.</a> J Neurochem. 93 (5), 1168-1176 (2006).</li><li>Bond, D., Primrose, D. A., Foley, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+evaluation+of+signaling+events+in+Drosophila+S2+cells.">Quantitative evaluation of signaling events in Drosophila S2 cells.</a> Biol Proceed Online. 10 (1), 20-28 (2008).</li><li>Wishart, T. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+proteomics+analysis+of+synaptic+proteins+identifies+potential+cellular+targets+and+protein+mediators+of+synaptic+neuroprotection+conferred+by+the+slow+Wallerian+degeneration+(Wlds)+gene.">Differential proteomics analysis of synaptic proteins identifies potential cellular targets and protein mediators of synaptic neuroprotection conferred by the slow Wallerian degeneration (Wlds) gene.</a> Mol Cell Proteomics. 6, 1318-1330 (2007).</li><li>Silva, J. M., McMahon, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+fastest+western+in+town:+a+contemporary+twist+on+the+classic+western+blot+analysis.">The fastest western in town: a contemporary twist on the classic western blot analysis.</a> J. Vis. Exp. (84), 51149 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

Une attention particulière et de la planification est essentielle avant toute expérience et peuvent en fin de compte déterminer le succès de la technique utilisée. Les progrès dans la détection de la protéine à l&#39;aide de la Banque mondiale peut présenter une pléthore d&#39;obstacles potentiels en essayant de choisir les anticorps, de transfert et de visualisation des méthodes appropriées à utiliser. Heureusement, en utilisant une liste de contrôle attentif et des mesures de contrôle appropriées QFWB peut être utilisée en routine pour déterminer la présence de la protéine et des différences d&#39;expression de plus en plus subtiles entre les échantillons. Ce protocole fournit un guide complet fluorescent western blot quantitatif ainsi que quelques stratégies de dépannage pour éviter et / ou de surmonter quelques-uns des nombreux écueils les plus courants associés. Les étapes essentielles utilisées pour maintenir la sensibilité et obtenir vraiment des mesures quantifiables et comparables comprennent: 1) l&#39;extraction des protéines robuste à partir d&#39;échantillons de tissus; 2) la préparation des échantillons; 3) précise loadin de protéinesg déterminée par l&#39;analyse des protéines totales; 4) un transfert optimal de protéines en utilisant I-Blot; 5) la préparation d&#39;anticorps primaires et secondaires dans le tampon de blocage contenant 0,1% de Tween 20, et 6) visualisation correcte et analyse à l&#39;aide d&#39;un imageur infrarouge et les logiciels associés. Détection fluorescente infrarouge est vraiment quantitative et offre une plus grande sensibilité par rapport à d&#39;autres techniques de détection ECL traditionnelles 3,11. Ce système de détection est à plusieurs facettes, et en tant que tel ne se limite pas à QFWB. Ce système est capable de formation d&#39;image de marquage immunohistochimique à faible puissance permettant la visualisation et la quantification des coupes de tissus entiers 12. Ceci est une zone de développement potentiel futur en termes de résolution qui pourrait voir l&#39;imagerie rouge lointain rivalisant avec capture d&#39;immunofluorescence conventionnelle avec des microscopes conventionnels en termes d&#39;évaluation quantitative. Cependant, avec une plus grande sensibilité à des changements subtils dans protein expression, il est essentiel de veiller à la variabilité est réduite au minimum et les mesures de contrôle sont strictes avec des protocoles robustes. Cela commence avec l&#39;extraction des protéines rigoureuse de l&#39;échantillon de tissu suivie par la production de protéines colorées au total gels à fournir l&#39;assurance que le chargement des échantillons est uniforme, optimisation des anticorps primaires et secondaires afin de déterminer si la détection est réel et tester les directives du fabricant en ce qui concerne le transfert fois pour obtenir le transfert de la protéine efficace. Néanmoins, même lorsque les conditions de la Banque mondiale sont optimisés, il peut y avoir encore des problèmes associés à la gestion des westerns qui peuvent ne pas avoir été pleinement explorées ici. Ceux-ci comprennent, sans s&#39;y limiter, les facteurs, y compris la solubilisation de la protéine et le choix de tampon d&#39;extraction. Des tampons peuvent interférer avec des dosages de la concentration de protéine, et certains tissus sont particulièrement difficiles à solubiliser, ce qui nécessite des techniques plus robustes telles que l&#39;utilisation de macération automatiséTing emballage étanche, tel que M TUBES ensemble avec un dissociateur Mac. En outre, des mesures de contrôle simples pour le stockage de la matière extraite et non extraite à -80 ° C peuvent faire la différence entre l&#39;obtention d&#39;étiquetage optimale immédiatement après l&#39;extraction et ayant pauvres résultats semaines plus tard. Méthodes de QFWB modernes se sont révélés être plus sensible pour capturer des différences subtiles dans l&#39;expression des protéines et permettent aux plus polyvalent simultanée double étiquetage 3 par rapport aux techniques plus anciennes comme ECL. Il est essentiel que les protocoles de transfert de Western sont robustes et facilement reproductible pour la quantification précise et l&#39;analyse statistique. Ce protocole est sensible et suffisamment robuste pour être utilisée en routine pour la détection de protéines à travers une série d&#39;échantillons de tissus et d&#39;espèces différentes et 3 permet la quantification des protéines de faible abondance et élevés à l&#39;intérieur de la même QFWB réduisant par conséquent l&#39;utilisation des consommables ainsi que le temps pour l&#39;expérience 1. 1 En outre, la sensibilité accrue de cette technique permet la validation de plus en plus populaire - études omiques 9,14 Cependant, l&#39;exactitude est cruciale et l&#39;inclusion de mesures de contrôle appropriées doivent être respectées évitant ainsi l&#39;acquisition de données erronées.

Western Blot (WB) est une technique d&#39;analyse développé à l&#39;origine dans les années 1970 pour déterminer la présence ou l&#39;absence d&#39;une protéine d&#39;intérêt dans un échantillon biologique complexe, comme un homogénat de tissu 1. Communément dénommé immunoblot des protéines, en raison de la clé interaction anticorps-antigène, la méthode consiste en cinq étapes distinctes: 1) la séparation électrophorétique des protéines par leur point isoélectrique; 2) le transfert à une nitrocellulose ou polyfluorure de vinylidène (PVDF); 3) le marquage en utilisant un anticorps primaire spécifique à la protéine d&#39;intérêt; 4) incubation avec un anticorps secondaire dirigé contre l&#39;anticorps primaire; et 5) la visualisation. méthodologie de visualisation a évolué avec le temps pour améliorer la sécurité et de la sensibilité. Certains des premiers Western Blots ont été réalisées en utilisant la radio balises marquées qui ensuite évolué vers les chemilluminescent plus largement utilisé (ECL) des méthodes colorimétriques et puis. Radioactivity a été marqué directement sur ​​les sondes pour des antigènes spécifiques alors que les méthodes colorimétriques et ECL utilisent une technique de marquage indirect avec un rapporteur enzymatique tel que la peroxydase de phosphatase alcaline ou de la streptavidine de raifort (HRP) 2. L&#39;intensité de l&#39;étiquetage du produit luminescent ou chromogène est mesurée en utilisant la densitométrie par lequel la force du signal, fort ou faible, plus ou moins indique la présence de la protéine d&#39;intérêt dans l&#39;échantillon. ECL est la méthode plus sensible et donc favorisée mais toutes les deux trois méthodes ont été initialement mis au point sur ​​le film à rayons X avec des techniques d&#39;imagerie numérique plus sophistiqué ensuite établies 3. L&#39;avancement de l&#39;imagerie numérique de WB a non seulement permis à un chercheur de déterminer la présence ou l&#39;absence de leur protéine d&#39;intérêt, mais a également permis une déduction au niveau de l&#39;expression d&#39;une protéine choisie lorsqu&#39;on les compare aux autres échantillons et peut donc être considéré comme «semi-quantitative &amp; #8221 ;. Récemment, une technique de transfert de Western véritablement quantitative et plus sensibles ont été mis au point de sorte que le niveau de fluorescence mesurée est directement liée à la quantité et à l&#39;expression d&#39;une protéine unique dans un échantillon: quantitatif fluorescent western blot (QFWB). Lorsque l&#39;on compare avec l&#39;étiquetage QFWB ECL, l&#39;utilisation d&#39;un anticorps secondaire fluorescent génère un profil de détection linéaire 4. Ceci est en contraste avec les techniques ECL où la linéarité du signal se produit généralement avec des charges faibles en protéines est inférieure à 5 ug et la saturation de signal directement liés à l&#39;expression des protéines, à savoir, avec des gènes domestiques exprimés de manière ubiquitaire 5,6. Cette disparité est très probablement dû à un plus grand nombre de sites de liaison disponibles pour un substrat ECL avidine à se lier à un secondaire biotinylé, ce qui entraîne un risque plus élevé de potentiel de saturation du signal. Ceci est l&#39;une des principales raisons de la base ECL immuno étant désignées comme étant ONLy &quot;semi-quantitative» 7. Le point de signal de saturation est d&#39;une importance critique pour la mesure des différences subtiles dans les niveaux d&#39;expression et peut conduire à des mesures inexactes. Au cours des dernières années, l&#39;avènement des techniques protéomiques répandues détaillant de plus en plus la sensibilité et l&#39;identification des différences d&#39;expression subtiles a entraîné une dépendance croissante sur vraiment quantitative Western blot pour des expériences de validation 8,9. L&#39;application de la méthodologie sensible, dynamique et véritablement quantitative est donc crucial. Beaucoup de &quot;optimisés&quot; méthodes de transfert de Western ont été utilisés par des laboratoires indépendants, qui se révèlent souvent difficiles à mettre en place ou de reproduire en raison d&#39;ajustements méthodologiques subtils qui peuvent ne pas être dans les protocoles officiels et documentés. Ceci est un protocole établi et robuste pour QFWB et fournit des stratégies utiles pour la résolution des problèmes communs tha plust peut survenir au cours de la mise en œuvre. Ce protocole a été optimisé pour une utilisation avec des homogénats de cerveau de souris, mais a depuis été utilisé efficacement dans un large éventail d&#39;échantillons de tissus et les espèces 4,9,10. Variations de protocole de potentiel nécessaires pour résoudre les problèmes spécifiques sont inclus.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1024">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:427px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:255px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:224px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">RIPA Buffer</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10230544</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">M Tubes</td>
			<td style="width:255px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td>130-093-236</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:427px;">iBlot Transfer Stack, PVDF Regular</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>IB401001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">MagicMark XP Western Protein Standard (20-220 kDa)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5602</td>
			<td>Use in gel 1 for Western blotting</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">SeeBlue Pre-stained protein standard</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>LC5625&#160;</td>
			<td>Use in gel 2 Total protein stained gel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAge LDS Sample buffer 4X</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0007</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">NuPAGE MES SDS Running Buffer (for Bis-Tris Gels only) (20X)</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">NuPAGE Novex 4-12% Bis-Tris Gel 1.0 mm, 12 well</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td>NP0322BOX</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:427px;">PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET,*TRU-ME, PHOSPHATE BUFFERED SALINE TABLET</td>
			<td style="width:255px;">Sigma-Aldrich, UK</td>
			<td>P4417-100TAB</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Micro BCA, Protein Assay Kit</td>
			<td style="width:255px;">Fisher Scientific UK Ltd</td>
			<td>10249133</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Odyssey&#160; blocking buffer</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td>P/N 927-40000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Goat anti-Rabbit IgG (H+L), 0.5 mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68071</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 680RD Donkey anti-Mouse IgG (H+L), 0.5 mg&#160;</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-68072</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Goat anti-Rabbit IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32211</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">IRDye 800CW Donkey anti-Goat IgG (H + L), 0.5mg</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">926-32214</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">ODYSSEY CL Infra-red imager</td>
			<td style="width:255px;">Li-Cor Biosciences</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Call for quotation</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">iBlot 7-Minute Blotting System</td>
			<td style="width:255px;">Life technologies, UK</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>This model is no longer in production</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">InstantBlue Protein stain</td>
			<td style="width:255px;">Expedeon, UK</td>
			<td>ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:427px;">Revitablot western blot stripping buffer&#160;</td>
			<td>Rockland Immunochemicals Inc.</td>
			<td>MB-085-0050</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a guide to modern quantitative fluorescent western blotting with troubleshooting strategies

La fin des années 1970 ont vu la première utilisation déclarée publiquement du western blot, une technique pour évaluer la présence et l&#39;abondance relative des protéines spécifiques dans des échantillons biologiques complexes. Depuis lors, la méthodologie western blot est devenue un élément commun de la biologie moléculaire répertoire expérimental. Une recherche rapide de PubMed en utilisant le terme &quot;western blot&quot; suggère que plus de 220 000 manuscrits publiés ont fait usage de cette technique d&#39;ici l&#39;an 2014. Surtout, les dix dernières années ont vu des avancées d&#39;imagerie techniques couplées avec le développement marqueurs fluorescents de sensibles qui ont permis d&#39;améliorer la sensibilité et a donné encore plus de plages de détection linéaire. Le résultat est une fluorescence maintenant vraiment quantifiable fondé Western Blot (QFWB) qui permet aux biologistes d&#39;effectuer une analyse comparative de l&#39;expression avec une plus grande sensibilité et de précision que jamais auparavant. Beaucoup de &quot;optimisé&quot; western blotméthodes existent et sont utilisées dans différents laboratoires. Ceux-ci se révèlent souvent difficiles à mettre en œuvre en raison de l&#39;exigence de modifications procédurales subtiles mais sans papiers. Ce protocole fournit une description complète de la méthode d&#39;QFWB établi et robuste, avec des stratégies de résolution des problèmes.

Comme la sensibilité à QFWB et la plage linéaire de détection est supérieure à la détection ECL classique, il ya un certain nombre de mesures de contrôle qui sont essentiels pour assurer l&#39;exactitude des données sont collectées, facilitant ainsi l&#39;interprétation efficace. Tout d&#39;abord, l&#39;inclusion des échantillons témoins positifs comme représenté sur la figure 1. D&#39;autre part, l&#39;optimisation du transfert de garantir un mouvement équivalent de protéines de haut et de bas poids moléculaire à partir du gel à la membrane comme présenté dans la figure 2. En troisième lieu, l&#39;optimisation d&#39;anticorps, en particulier secondaire des anticorps dont l&#39;optimisation est souvent négligé, mais qui peuvent produire non spécifique bandes capables d&#39;interférer avec l&#39;interprétation correcte de la protéine (s) d&#39;intérêt. Voir Figure 3. Quatrièmement, il peut aussi être le cas que quand une protéine apparaît indétectable mais devrait être présente, cela peut aussi être une question d&#39;anticorps secondaire qui peut être corrigé en utilisant simplement un raïs secondairesed dans un hôte de différentes espèces. Voir figure 4. Cinquièmement, l&#39;étiquetage de la protéine totale et l&#39;analyse est une méthode beaucoup plus robuste et quantifiable par rapport à l&#39;utilisation unique de protéine traditionnel (s) qui sont exprimés de façon ubiquitaire à des étalons de référence internes 3. Beaucoup de ces protéines simples ont été trouvés à être exprimés de manière différentielle dans des modèles de maladies neurodégénératives, ainsi qu&#39;entre les échantillons de tissus différents et l&#39;uniformité d&#39;expression peut modifier dans le même tissu 3. Par conséquent, la production d&#39;un gel de commande de charge confirme l&#39;uniformité de la charge de l&#39;échantillon lorsqu&#39;il est combiné avec une analyse des protéines totales par la comparaison et la quantification de la charge de protéine dans chaque ligne à différentes gammes de poids moléculaires mesurés par rapport à chaque échantillon pour indiquer l&#39;erreur standard comme le montre la figure 6 . Fait important, l&#39;ensemble de ces techniques et des contrôles de dépannage ne sont efficaces que la sensibilité et la cohérence de l&#39;analyse tutils appliquées par l&#39;opérateur (figure 5). Enfin cette technique se prête bien à l&#39;arrachement et re-sondage de membranes avec plus de souplesse que ECL en raison de facteurs y compris, mais sans s&#39;y limiter, une sensibilité accrue, de fond réduit, la détection de double couleur et la stabilité de la membrane dans des conditions de stockage à long terme. Voir la Figure 7.

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A Guide to Modern Quantitative Fluorescent Western Blotting with Troubleshooting Strategies

The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.

Un Guide to Modern quantitative fluorescente Western blot avec des stratégies de dépannage

The late 1970s saw the first publicly reported use of the western blot, a technique for assessing the presence and relative abundance of specific proteins ...

a-guide-to-modern-quantitative-fluorescent-western-blotting-with

Research

JoVE Journal

Biology

50.7K vues.  University of Edinburgh. The advancement of western blotting using fluorescence has allowed detection of subtle changes in protein expression enabling quantitative analyses. Here we describe a robust methodology for detection of a range of proteins across a variety of species and tissue types. A strategy to overcome common technical problems is also provided.