カフェイン抽出、酵素活性、植物細胞懸濁液からのカフェイン合成酵素の遺伝子発現

この方法は、分析化学、生化学、バイオテクノロジー分野の重要な質問に答えるのに役立ちます。カフェイン生合成に起こる変化はどのようなものである。この技術の主な利点は、カフェインを産生するインビトロ植物モデルに適用できることである。

まず、凍結乾燥した細胞に10ミリリットルのアセトンを加え、フラスコを密封してからボルテックスミキサーと30秒間混合します。次に、100rpmで試料を室温で5時間回転器と混合する。この後、25マイクロリットルのアセトンでサンプルを再懸濁する。

まず、前に調製したカフェイン抽出物の1マイクロリットルをシリカゲルプレートに塗布する。次いで、移動相の10ミリリットルのクロマトグラフィーチャンバー、シクロヘキサンアセトンでTLCを開発する。コンパクトなUVランプで、短波長の紫外線でカフェインバンドを視覚化します。

この後、273ナノメートルの密度測定でカフェインレベルを定量化します。ろ紙を用いて、以前に調製した細胞懸濁液を真空濾過する。次いで、磁器モルタルを使用して、液体窒素およびRNA単離試薬を用いて、均質化されるまで細胞試料を浸食する。

次に、サンプル500マイクロリットルを無菌マイクロ遠心管に移す。次いで、クロロホルムイソアミルアルコールの300マイクロリットル、および平衡フェノールの300マイクロリットルを加える。渦ミキサーでサンプルを混ぜ、20,000Gで摂氏4度で15分間遠心分離します。

この後、上相の300マイクロリットルをきれいなマイクロ遠心管に移す。その後、イソプロパノールの200マイクロリットルを追加し、マイナス20°Cで1時間チューブをインキュベートします。ペレットに1ミリリットルのエタノールを加えます。

次いで、チューブを12,000Gで10分間遠心し、液相をデカン化する。次に、試料を室温で1.5時間乾燥させます。次いで、25マイクロリットルのDEPC処理水でRNA抽出物を再中断する。

まず、全RNA抽出物の2マイクログラムを無菌マイクロ遠心管に加えます。次に、10X反応バッファーの1マイクロリットルとDNaseの1マイクロリットルを加えます。DEPC処理水で10マイクロリットルに反応の最終容積を持って来なさい。

その後、サンプルと遠心分離機を2,000Gで1分間混ぜます。次に、37°Cで30分間インキュベートします。この後、50ミクロモル二ナトリウムの1マイクロリットルをエチレンジアミンテトラセテートを加え、反応を停止させた。

サンプルを摂氏65度で10分間インキュベートします。次に、アガロースゲルに100ナノグラムのRNAを塗布し、ゲルを実行します。ゲル写真ドキュメンテーションシステムを使用してRNAの完全性を可視化します。

まず、マイクロ遠心分離管に合計RNAの2.5マイクログラムを加えます。次に、オリゴデオキシチミジンプライマーを1マイクロリットル加え、ヌクレアーゼを含まない水でチューブを13マイクロリットルの最終体積に充填します。サンプルを混ぜ、2,000Gで遠心分離機を1分間混ぜます。

サンプルを摂氏65度で5分間インキュベートします。そして、2分間摂氏4度で。次に、5X反応バッファーの4マイクロリットル、dNTPミックスの2マイクロリットル、および1マイクロリットルの逆転写酵素をサンプルに加える。

その後、サンプルを2,000Gで1分間軽く遠心分離機で混ぜます。この後、サンプルを摂氏45度で50分間インキュベートし、摂氏70度で10分間インキュベートします。7.5マイクロリットルの2X Taq DNAポリメラーゼと0.1マイクロモルのRAXを、PCRマイクロ遠心チューブに加えます。

次に、各フォワードおよびリバースプライマーを0.75マイクロリットル加え、CCS1遺伝子を増幅する。その後、600 ナノグラムの CDNA テンプレートを追加します。テキストプロトコルに記載されているように、増幅反応をリアルタイムPCRでプリフォームする。

次に、PCR ソフトウェアを使用してデータを分析します。細胞材料の1グラムを計量し、アルミホイルでそれをパックします。サンプルを浸食した後、ガラスバイアルに移し、2.5ミリリットルの抽出バッファーを加えます。

次に、試料を摂氏4度で20分間20,000Gで遠心分離する。500マイクロリットルのアリコートを極低温バイアルに移す。分光光度計を用いて、ビチンコニン酸アッセイを用いて562ナノメートルのサンプルのタンパク質濃度を測定し、牛セリックアルブミンを標準にします。

まず、テキストプロトコルに従って、マイクロ遠心分離管で反応混合物を調製する。その後、100 ミリモルトリス HCL で合計体積を 200 マイクロリットルに増やします。放射性物質との反応混合物の調製中に、あなた自身の安全が適切な予防措置に従うことを覚えておいてください。

氷の上にマイクロ遠心チューブを維持し、タンパク質の7〜9ミリグラムを含む可溶性分画の体積を追加します。その後、混合物をボルテックスし、30分間摂氏30度でインキュベートする。この後、サンプルを11,000Gで5分間遠心する。

次に、900マイクロリットルの体積を慎重に回収し、サンプルをシンチレーションバイアルに移す。次に、クロロホルムを蒸発させて、室温でボンネット内の乾燥を完了します。バイアルに5ミリリットルのシンチレーション液を加えます。

最後に、シンチレーションカウンターを用いてカフェインに組み込まれた放射能を分析する。このプロトコルでは、カフェインの吸光度のパターンをTLC濃度測定を介して分析し、可視光スペクトルを介して、273ナノメートルで最大吸収で読み取った。TLCプレート上のカフェインの分離曲線は、0.34、および0.39の間のRFを示した。

懸濁細胞由来のRNAは、28、18および5s RRNAサブユニットの明確な分離を示し、サンプルが高品質であることを示す。最後に、QPCR分析からメルト曲線を得て、カフェイン合成酵素遺伝子に対する単一の増幅産物を示した。その開発後、この技術は、バイオテクノロジーと生化学の分野の研究者がコーヒー、紅茶、ココから二次代謝組織培養を探求する道を開きました。

放射能や分子病理学を扱うことは非常に危険であり、この手順を実行する際には、手袋、ゴーグル、放射性物質の特別な機器の使用などの予防措置を常に講じなければならないことを忘れないでください。