Este método puede ayudar a responder preguntas clave en los campos de la química analítica, la bioquímica y la biotecnología. Por ejemplo, ¿cuáles son los cambios que se producen en la biosíntesis de cafeína. La principal ventaja de esta técnica, es que se puede aplicar a modelos de plantas invitro que produce cafeína.
Para comenzar, agregue 10 mililitros de acetona a las células liofilizadas, y selle el matraz antes de mezclarlo con el mezclador de vórtice durante 30 segundos. A continuación, mezcle la muestra a 100 rpm con un rotador durante cinco horas a temperatura ambiente. Después de esto, vuelva a suspender la muestra con 25 microlitros de acetona.
En primer lugar, aplicar un microlitro del extracto de cafeína previamente preparado en las placas de gel de sílice. A continuación, desarrollar el TLC en la cámara de cromatografía con 10 mililitros de la fase móvil, acetona de ciclohexano. Visualice las bandas de cafeína en longitud de onda corta ultravioleta, con una lámpara UV compacta.
Después de esto, cuantificar los niveles de cafeína por densitometría a 273 nanómetros. Con papel de filtro, filtre al vacío la suspensión celular previamente preparada. A continuación, utilice un mortero de porcelana para macerar la muestra celular, con nitrógeno líquido y reactivo de aislamiento de ARN, hasta que se homogeneice.
A continuación, transfiera 500 microlitros de la muestra a un tubo estéril de micro centrífuga. A continuación, agregue 300 microlitros de alcohol isoamilo cloroformo y 300 microlitros de fenol equilibrado. Mezcle la muestra con un mezclador de vórtice y centrifugarlo a 20.000G durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Después de esto, transfiera 300 microlitros de la fase superior a un tubo de micro centrífuga limpia. Luego, agregue 200 microlitros de isopropanol e incubar el tubo durante una hora a 20 grados Celsius negativos. Añadir un mililitro de etanol al pellet.
A continuación, centrifugar el tubo a 12.000G durante 10 minutos y decantar la fase líquida. A continuación, seque la muestra durante 1,5 horas a temperatura ambiente. A continuación, vuelva a suspender el extracto de ARN con 25 microlitros de agua tratada con DEPC.
En primer lugar, añadir dos microgramos de extracto total de ARN a un tubo de micro centrífuga estéril. A continuación, agregue un microlitrotro de búfer de reacción 10X y un microlitro de DNase. Lleve el volumen final de la reacción a 10 microlitros con agua tratada con DEPC.
A continuación, mezcle la muestra y la centrífuga a 2.000G durante un minuto. A continuación, incubar la muestra a 37 grados centígrados durante 30 minutos. Después de esto, añadir un microlitro de 50 micromolar disódico etileno diamina tetraacetato, para detener la reacción.
Incubar la muestra a 65 grados centígrados durante 10 minutos. A continuación, aplicar 100 nanogramos de ARN a un gel de agarosa y ejecutar el gel. Visualice la integridad del ARN utilizando un sistema de documentación fotográfica de gel.
En primer lugar, añadir 2,5 microgramos de ARN total a un tubo de micro centrífuga. A continuación, agregue un microlitros de la imprimación de desoximidina de oligo y llene el tubo a un volumen final de 13 microlitros con agua libre de nucleasas. Mezcle la muestra y centríféquela a 2.000G durante un minuto.
Incubar la muestra a 65 grados centígrados durante cinco minutos. Y luego a cuatro grados centígrados durante dos minutos. A continuación, añada cuatro microlitros de búfer de reacción 5X, dos microlitros de mezcla dNTP y un microlitr de transcriptasa inversa a la muestra.
A continuación, mezcle la muestra suavemente y centrifugar a 2.000G durante un minuto. Después de esto, incuba la muestra a 45 grados centígrados durante 50 minutos, y luego a 70 grados celsius durante 10 minutos. Añadir 7,5 microlitros de 2X Taq DNA polimerasa y 0,1 micromoles de RAX, a un tubo de micro centrífuga PCR.
A continuación, agregue 0,75 microlitros cada uno de imprimación hacia adelante y hacia atrás para amplificar el gen CCS1. Después de esto, agregue 600 nanogramos de plantilla CDNA. Preformar la reacción de amplificación en tiempo real PCR como se describe en el protocolo de texto.
Entonces, analice los datos con el software PCR. Pesar un gramo de material celular y empacarlo en papel de aluminio. Después de macerar la muestra, transfiétela a un vial de vidrio y agregue 2,5 mililitros de tampón de extracción.
A continuación, centrifugar la muestra a 20.000G durante 20 minutos a cuatro grados centígrados. Transfiera 500 microlitros alícuotas alícuotas en viales criogénicos. Con un espectrofotómetro, mida la concentración proteica de la muestra a 562 nanómetros utilizando un ensayo de ácido bicinchoninic, con la albúmina serica bovina como estándar.
En primer lugar, preparar la mezcla de reacción en un tubo de micro centrífuga, de acuerdo con el protocolo de texto. A continuación, aumente el volumen total a 200 microlitros con 100 tris milimétricos HCL. Recuerde, es imperativo que su propia seguridad siga las precauciones adecuadas durante la preparación de la mezcla de reacción con material radiactivo.
Mantenga el tubo de micro centrífuga sobre hielo y agregue un volumen de la fracción soluble, que contenga de siete a nueve miligramos de proteína. Luego, vórtice la mezcla e incubar a 30 grados Centígrados durante 30 minutos. Después de esto, centrifugar las muestras a 11.000G durante cinco minutos.
A continuación, recupere cuidadosamente un volumen de 900 microlitros y transfiera las muestras a un vial de centelleo. A continuación, evapore el cloroformo para completar la sequedad en la campana a temperatura ambiente. Añadir cinco mililitros de líquido de centelleo al vial.
Finalmente, analizar la radiactividad incorporada en la cafeína utilizando un contador de centelleo. En este protocolo, el patrón de absorbancia para la cafeína se analizó a través de la densitometría TLC, a través del espectro de luz visible, y la lectura en máxima absorción a 273 nanómetros. La curva de separación de cafeína en la placa TLC, mostró una RF entre 0.34, y 0.39.
El ARN derivado de células suspendidas exhibe separaciones claras de las subunidades de ARNr 28, 18s y 5s, lo que indica que las muestras eran de alta calidad. Finalmente, se obtuvo una curva de fusión del análisis QPCR, mostrando un único producto de amplificación para el gen de la cafeína sintasa. Después de su desarrollo, esta técnica allanó el camino para que los investigadores en los campos de la biotecnología y la bioquímica exploraran el cultivo secundario de tejido metabolizante a partir del café, el té y el coco.
No olvide que trabajar con radiactividad y patología molecular puede ser extremadamente peligroso, y siempre se tomarán precauciones como el uso de guantes, gafas y equipos especiales para material radiactivo al realizar este procedimiento.
