Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans les domaines de la chimie analytique, de la biochimie et de la biotechnologie. Par exemple, quels sont les changements qui se produisent dans la biosynthèse de la caféine. Le principal avantage de cette technique, c’est qu’elle peut être appliquée aux modèles de plantes invitro qui produisent de la caféine.
Pour commencer, ajouter 10 millilitres d’acétone aux cellules lyophilisées et sceller le flacon avant de mélanger avec le mélangeur vortex pendant 30 secondes. Ensuite, mélanger l’échantillon à 100 rpm avec un rotateur pendant cinq heures à température ambiante. Après cela, suspendre à nouveau l’échantillon avec 25 microlitres d’acétone.
Tout d’abord, appliquez un microlitre de l’extrait de caféine précédemment préparé sur les plaques de gel de silice. Ensuite, développez le TLC dans la chambre de chromatographie avec 10 millilitres de la phase mobile, l’acétone cyclohexane. Visualisez les bandes de caféine en ultraviolet à longueur d’onde courte, à l’aide d’une lampe UV compacte.
Après cela, quantifier les niveaux de caféine par densitométrie à 273 nanomètres. À l’aide de papier filtre, filtrer sous vide la suspension cellulaire préparée précédemment. Ensuite, utilisez un mortier en porcelaine pour macérer l’échantillon cellulaire, avec de l’azote liquide et un réagenage d’isolement de l’ARN, jusqu’à ce qu’il soit homogénéisé.
Ensuite, transférez 500 microlitres de l’échantillon dans un tube stérile de micro centrifugeuse. Ajoutez ensuite 300 microlitres d’alcool d’isoamyle chloroforme et 300 microlitres de phénol équilibré. Mélanger l’échantillon avec un mélangeur vortex et le centrifuger à 20 000 G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.
Après cela, transférer 300 microlitres de la phase supérieure dans un tube de micro centrifugeuse propre. Ensuite, ajouter 200 microlitres d’isopropanol et incuber le tube pendant une heure à 20 degrés Celsius négatifs. Ajouter un millilitre d’éthanol à la pastille.
Ensuite, centrifugez le tube à 12 000 G pendant 10 minutes et décantez la phase liquide. Ensuite, séchez l’échantillon pendant 1,5 heure à température ambiante. Ensuite, suspendez à nouveau l’extrait d’ARN avec 25 microlitres d’eau traitée par DEPC.
Tout d’abord, ajouter deux microgrammes d’extrait total d’ARN à un tube stérile de micro centrifugeuse. Ensuite, ajoutez un microlitre de tampon de réaction 10X et un microlitre de DNase. Apportez le volume final de la réaction à 10 microlitres avec de l’eau traitée par DEPC.
Ensuite, mélanger l’échantillon et la centrifugeuse à 2000G pendant une minute. Ensuite, incubez l’échantillon à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après cela, ajouter un microlitre de 50 micromolaire disodium éthylène diamine tétraacetate, pour arrêter la réaction.
Incuber l’échantillon à 65 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, appliquez 100 nanogrammes d’ARN sur un gel d’agarose et exécutez le gel. Visualisez l’intégrité de l’ARN à l’aide d’un système de documentation photo gel.
Tout d’abord, ajouter 2,5 microgrammes d’ARN total à un tube de micro centrifugeuse. Ensuite, ajoutez un microlitre d’amorce oligo deoxythymidine et remplissez le tube à un volume final de 13 microlitres avec de l’eau sans nucléase. Mélanger l’échantillon et le centrifuger à 2000G pendant une minute.
Incuber l’échantillon à 65 degrés Celsius pendant cinq minutes. Et puis à quatre degrés Celsius pendant deux minutes. Ensuite, ajoutez quatre microlitres de tampon de réaction 5X, deux microlitres de mélange dNTP et un microlitre de transcriptase inverse à l’échantillon.
Ensuite, mélanger l’échantillon doucement et la centrifugeuse à 2000G pendant une minute. Après cela, incuber l’échantillon à 45 degrés Celsius pendant 50 minutes, puis à 70 degrés Celsius pendant 10 minutes. Ajouter 7,5 microlitres de polymésase d’ADN 2X Taq et 0,1 micromoles de RAX à un tube de micro centrifugeuse PCR.
Ensuite, ajoutez 0,75 microlitres chacun d’amorce avant et arrière pour amplifier le gène CCS1. Après cela, ajouter 600 nanogrammes de modèle CDNA. Préformer la réaction d’amplification en temps réel PCR tel que décrit dans le protocole de texte.
Ensuite, analyser les données avec le logiciel PCR. Pesez un gramme de matière cellulaire et emballez-le dans du papier d’aluminium. Après macération de l’échantillon, transférez-le sur un flacon de verre et ajoutez 2,5 millilitres de tampon d’extraction.
Ensuite, centrifugez l’échantillon à 20 000 G pendant 20 minutes à quatre degrés Celsius. Transférer 500 microlitres aliquots dans des flacons cryogéniques. À l’aide d’un spectrophotomètre, mesurer la concentration protéique de l’échantillon à 562 nanomètres à l’aide d’un test d’acide bicinchoninique, avec de l’albumine sérique bovine comme norme.
Tout d’abord, préparer le mélange de réaction dans un tube de micro centrifugeuse, selon le protocole de texte. Ensuite, augmenter le volume total à 200 microlitres avec 100 millimolar tris HCL. Rappelez-vous, il est impératif pour votre propre sécurité de suivre les précautions appropriées pendant la préparation du mélange de réaction avec des matières radioactives.
Gardez le tube de micro centrifugeuse sur la glace et ajoutez un volume de la fraction soluble, contenant de sept à neuf milligrammes de protéines. Ensuite, vortex le mélange et incuber à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après ça, centrifuger les échantillons à 11 000 G pendant cinq minutes.
Ensuite, récupérez soigneusement un volume de 900 microlitres, et transférez les échantillons sur un flacon de scintillation. Ensuite, évaporez le chloroforme pour compléter la sécheresse dans le capot à température ambiante. Ajouter cinq millilitres de liquide de scintillation au flacon.
Enfin, analyser la radioactivité incorporée dans la caféine à l’aide d’un compteur de scintillation. Dans ce protocole, le modèle d’absorption pour la caféine a été analysé par la densitométrie de TLC, par le spectre visible de lumière, et la lecture dans l’absorption maximale à 273 nanomètres. La courbe de séparation de la caféine sur la plaque de TLC, a montré un RF entre 0.34, et 0.39.
L’ARN dérivé des cellules suspendues présente des séparations claires des sous-unités RRNA des années 28, 18 et 5, ce qui indique que les échantillons étaient de haute qualité. Enfin, une courbe de fonte a été obtenue à partir de l’analyse QPCR, montrant un produit d’amplification unique pour le gène synthase de caféine. Après son développement, cette technique a ouvert la voie à des chercheurs dans les domaines de la biotechnologie et de la biochimie pour explorer la culture secondaire des tissus métabolisants à partir du café, du thé et du coco.
N’oubliez pas que travailler avec la radioactivité et la pathologie moléculaire peut être extrêmement dangereux, et des précautions telles que l’utilisation de gants, lunettes et équipements spéciaux pour les matières radioactives doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.
