Diese Methode kann helfen, Schlüsselfragen in den Bereichen analytische Chemie, Biochemie und Biotechnologie zu beantworten. Wie, was sind die Veränderungen, die in der Koffein-Biosynthese auftreten. Der Hauptvorteil dieser Technik ist, dass sie auf Invitro-Pflanzenmodelle angewendet werden kann, die Koffein produzieren.
Um zu beginnen, fügen Sie 10 Milliliter Aceton zu den lyophilisierten Zellen hinzu, und versiegeln Sie den Kolben, bevor Sie ihn 30 Sekunden lang mit dem Wirbelmischer mischen. Dann mischen Sie die Probe bei 100 Rpm mit einem Rotator für fünf Stunden bei Raumtemperatur. Danach die Probe mit 25 Mikroliter Aceton erneut aussetzen.
Zuerst einen Mikroliter des zuvor hergestellten Koffeinextrakts auf die Kieselgelplatten auftragen. Entwickeln Sie dann den TLC in der Chromatographiekammer mit 10 Millilitern der mobilen Phase, Cyclohexanaceton. Visualisieren Sie die Koffeinbänder in kurzwelliger Ultraviolettlänge mit einer kompakten UV-Lampe.
Danach quantifizieren Sie den Koffeingehalt durch Densitometrie bei 273 Nanometern. Mit Filterpapier die zuvor vorbereitete Zellsuspension vakuumfiltern. Verwenden Sie dann einen Porzellanmörtel, um die Zellprobe mit flüssigem Stickstoff und RNA-Isolationsreagenz zu mazerieren, bis sie homogenisiert ist.
Als nächstes 500 Mikroliter der Probe in ein steriles Mikrozentrifugenrohr übertragen. Fügen Sie dann 300 Mikroliter Chloroform-Isoamylalkohol und 300 Mikroliter gleichgewichtiertes Phenol hinzu. Mischen Sie die Probe mit einem Wirbelmischer und zentrifugieren Sie es bei 20, 000G für 15 Minuten bei vier Grad Celsius.
Danach 300 Mikroliter der oberen Phase in ein sauberes Mikrozentrifugenrohr übertragen. Dann fügen Sie 200 Mikroliter Isopropanol und inkubieren Sie die Röhre für eine Stunde bei negativen 20 Grad Celsius. Fügen Sie dem Pellet einen Milliliter Ethanol hinzu.
Zentrifugieren Sie dann das Rohr 10 Minuten lang bei 12 000G und dekantieren Sie die flüssige Phase. Als nächstes trocknen Sie die Probe für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur. Anschließend wird der RNA-Extrakt mit 25 Mikroliter dePC-behandeltem Wasser wieder ausgesetzt.
Fügen Sie zunächst zwei Mikrogramm des gesamten RNA-Extrakts zu einem sterilen Mikrozentrifugenrohr hinzu. Fügen Sie dann einen Mikroliter 10X Reaktionspuffer und einen Mikroliter DNase hinzu. Bringen Sie das endige Volumen der Reaktion auf 10 Mikroliter mit DEPC-behandeltem Wasser.
Dann mischen Sie die Probe und Zentrifuge bei 2 000G für eine Minute. Als nächstes inkubieren Sie die Probe bei 37 Grad Celsius für 30 Minuten. Danach einen Mikroliter 50 Mikromolar-Dinatriumethylendiamin-Tetraacetat hinzufügen, um die Reaktion zu stoppen.
Inkubieren Sie die Probe bei 65 Grad Celsius für 10 Minuten. Dann 100 Nanogramm RNA auf ein Agarose-Gel auftragen und das Gel laufen lassen. Visualisieren Sie die Integrität der RNA mit einem Gel-Foto-Dokumentationssystem.
Fügen Sie zunächst 2,5 Mikrogramm Gesamt-RNA zu einem Mikrozentrifugenröhrchen hinzu. Dann einen Mikroliter Oligo-Desoxythymidin-Primer hinzufügen und das Rohr auf ein Endvolumen von 13 Mikrolitern mit nukleasefreiem Wasser füllen. Mischen Sie die Probe und zentrifugieren Sie sie bei 2 000G für eine Minute.
Inkubieren Sie die Probe bei 65 Grad Celsius für fünf Minuten. Und dann bei vier Grad Celsius für zwei Minuten. Als nächstes fügen Sie der Probe vier Mikroliter 5X Reaktionspuffer, zwei Mikroliter dNTP-Mix und einen Mikroliter Reverse-Transkriptase hinzu.
Dann mischen Sie die Probe sanft und Zentrifuge bei 2 000G für eine Minute. Danach, inkubieren Sie die Probe bei 45 Grad Celsius für 50 Minuten, und dann bei 70 Grad Celsius für 10 Minuten. Fügen Sie 7,5 Mikroliter 2X Taq DNA-Polymerase und 0,1 Mikromol von RAX zu einem PCR-Mikrozentrifugenrohr hinzu.
Fügen Sie dann jeweils 0,75 Mikroliter Vorwärts- und Rückwärtsgrundierung hinzu, um das CCS1-Gen zu verstärken. Fügen Sie danach 600 Nanogramm CDNA-Vorlage hinzu. Die Amplifikationsreaktion in Echtzeit PCR, wie im Textprotokoll beschrieben, vorformen.
Analysieren Sie dann die Daten mit der PCR-Software. Wiegen Sie ein Gramm Zellmaterial ab und verpacken Sie es in Aluminiumfolie. Nach dem Mazerieren der Probe in eine Glasdurchstechflasche geben und 2,5 Milliliter Extraktionspuffer hinzufügen.
Als nächstes zentrifugieren Sie die Probe bei 20, 000G für 20 Minuten bei vier Grad Celsius. Übertragen Sie 500 Mikroliter Aliquots in kryogene Fläschchen. Mit einem Spektralphotometer messen Sie die Proteinkonzentration der Probe bei 562 Nanometern mit einem Bicinchoninsäure-Assay, wobei Rinderseralbumin als Standard verwendet wird.
Bereiten Sie zunächst das Reaktionsgemisch in einem Mikrozentrifugenrohr gemäß dem Textprotokoll vor. Dann erhöhen Sie das Gesamtvolumen auf 200 Mikroliter mit 100 Millimolaren Tris HCL. Denken Sie daran, es ist für Ihre eigene Sicherheit zwingend erforderlich, bei der Vorbereitung von Reaktionsgemisch mit radioaktivem Material die richtigen Vorsichtsmaßnahmen zu befolgen.
Halten Sie die Mikrozentrifuge Tube auf Eis und fügen Sie ein Volumen der löslichen Fraktion, die sieben bis neun Milligramm Protein enthält. Dann wirbeln Sie die Mischung und inkubieren bei 30 Grad Celsius für 30 Minuten. Danach zentrieren Sie die Proben bei 11 000G für fünf Minuten.
Dann, sorgfältig ein Volumen von 900 Mikroliter zurückgewinnen, und übertragen Sie die Proben in eine Szintillations-Fläschigkeit. Als nächstes verdampfen Sie die Chloroform, um die Trockenheit in der Haube bei Raumtemperatur zu vervollständigen. Fügen Sie fünf Milliliter Szintillationsflüssigkeit in die Durchstechflasche.
Schließlich analysieren Sie die Radioaktivität in das Koffein mit einem Szintillationszähler. In diesem Protokoll wurde das Muster der Absorption von Koffein über TLC-Densitometrie, durch das sichtbare Lichtspektrum und das Lesen bei maximaler Absorption bei 273 Nanometern analysiert. Die Trennungskurve von Koffein auf der TLC-Platte zeigte einen RF zwischen 0,34 und 0,39.
Die aus suspendierten Zellen abgeleitete RNA weist klare Trennungen der 28er-, 18er- und 5s-RRNA-Untereinheiten auf, was darauf hindeutet, dass die Proben von hoher Qualität waren. Schließlich wurde aus der QPCR-Analyse eine Schmelzkurve gewonnen, die ein einziges Amplifikationsprodukt für das Koffeinsynthase-Gen zeigt. Nach ihrer Entwicklung ebnete diese Technik den Weg für Forscher in den Bereichen Biotechnologie und Biochemie, um die sekundäre metabolisierende Gewebekultur aus Kaffee, Tee und Coco zu erforschen.
Vergessen Sie nicht, dass die Arbeit mit Radioaktivität und molekularer Pathologie extrem gefährlich sein kann, und Vorsichtsmaßnahmen wie die Verwendung von Handschuhen, Schutzbrillen und spezialgeräten für radioaktives Material sind bei der Durchführung dieses Verfahrens immer zu treffen.
