Este método pode ajudar a responder questões-chave nos campos de química analítica, bioquímica e biotecnologia. Tais como, quais são as mudanças que ocorrem na biossíntese da cafeína. A principal vantagem dessa técnica, é que ela pode ser aplicada a modelos de plantas invitro que produzem cafeína.
Para começar, adicione 10 mililitros de acetona às células liofilizadas e sele o frasco antes de misturar com o misturador de vórtice por 30 segundos. Em seguida, misture a amostra a 100 rpm com um rotador por cinco horas em temperatura ambiente. Depois disso, suspenda a amostra com 25 microliters de acetona.
Primeiro, aplique um microliter do extrato de cafeína previamente preparado nas placas de gel de sílica. Em seguida, desenvolva o TLC na câmara de cromatografia com 10 mililitros da fase móvel, acetona ciclohexana. Visualize as faixas de cafeína em ultravioleta de comprimento de onda curto, com uma lâmpada UV compacta.
Depois disso, quantifique os níveis de cafeína por densitometria a 273 nanômetros. Utilizando papel filtro, filtro de vácuo a suspensão celular previamente preparada. Em seguida, use uma argamassa de porcelana para macerar a amostra celular, com nitrogênio líquido e reagente de isolamento de RNA, até que seja homogeneizada.
Em seguida, transfira 500 microliters da amostra para um tubo micro centrífuga estéril. Em seguida, adicione 300 microliters de álcool clorofórmio isoamyl, e 300 microliters de fenol equilibrado. Misture a amostra com um misturador de vórtice e centrífuga a 20.000G por 15 minutos a quatro graus Celsius.
Depois disso, transfira 300 microliters da fase superior para um tubo de micro centrífuga limpa. Em seguida, adicione 200 microliters de isopropanol e incubar o tubo por uma hora a 20 graus negativos Celsius. Adicione um mililitro de etanol à pelota.
Em seguida, centrifugar o tubo a 12.000G por 10 minutos e decantar a fase líquida. Em seguida, seque a amostra por 1,5 horas em temperatura ambiente. Em seguida, suspenda novamente o extrato de RNA com 25 microliters de água tratada com DEPC.
Primeiro, adicione dois microgramas de extrato total de RNA a um tubo de micro centrífuga estéril. Em seguida, adicione um microliter de tampão de reação 10X e um microliter de DNase. Leve o volume final da reação para 10 microliters com água tratada com DEPC.
Em seguida, misture a amostra e a centrífuga a 2.000G por um minuto. Em seguida, incubar a amostra a 37 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, adicione um microliter de 50 micromolar disodium etileno diamina tetraacetato, para parar a reação.
Incubar a amostra a 65 graus Celsius por 10 minutos. Em seguida, aplique 100 nanogramas de RNA em um gel de agarose e execute o gel. Visualize a integridade do RNA usando um sistema de documentação de fotos em gel.
Primeiro, adicione 2,5 microgramas de RNA total a um tubo de micro centrífuga. Em seguida, adicione um microliter de primer deoximidina oligo e encha o tubo a um volume final de 13 microliters com água sem nuclease. Misture a amostra e centrífuga a 2.000G por um minuto.
Incubar a amostra a 65 graus Celsius por cinco minutos. E então a 4 graus Celsius por dois minutos. Em seguida, adicione quatro microliters de tampão de reação 5X, dois microliters de mix dNTP e um microliter de transcriptase reversa à amostra.
Em seguida, misture a amostra suavemente e centrífuga a 2.000G por um minuto. Depois disso, incubar a amostra a 45 graus Celsius por 50 minutos e, em seguida, a 70 graus Celsius por 10 minutos. Adicione 7,5 microliters de polimerase de DNA 2X Taq e 0,1 micromoles de RAX, a um tubo de micro centrífuga PCR.
Em seguida, adicione 0,75 microliters cada um do primer dianteiro e reverso para amplificar o gene CCS1. Depois disso, adicione 600 nanogramas do modelo CDNA. Préforme a reação de amplificação em tempo real pcr como descrito no protocolo de texto.
Em seguida, analise os dados com o software PCR. Pese um grama de material celular e embale-o em papel alumínio. Depois de macerar a amostra, transfira-a para um frasco de vidro e adicione 2,5 mililitros de tampão de extração.
Em seguida, centrifugar a amostra a 20.000G por 20 minutos a quatro graus Celsius. Transfira 500 alíquotas de microliters em frascos criogênicos. Com um espectrofotômetro, meça a concentração proteica da amostra em 562 nanômetros usando um ensaio de ácido bicinchonínico, com albumina bovina sênica como padrão.
Primeiro, prepare a mistura de reação em um tubo de micro centrífuga, de acordo com o protocolo de texto. Em seguida, aumente o volume total para 200 microliters com 100 tris mililitros HCL. Lembre-se, é imprescindível para sua própria segurança seguir as precauções adequadas durante a preparação da mistura de reação com material radioativo.
Mantenha o tubo de micro centrífuga no gelo e adicione um volume da fração solúvel, contendo de sete a nove miligramas de proteína. Em seguida, vórtice da mistura e incubar a 30 graus Celsius por 30 minutos. Depois disso, centrifufique as amostras a 11.000G por cinco minutos.
Em seguida, recupere cuidadosamente um volume de 900 microliters, e transfira as amostras para um frasco de cintilação. Em seguida, evaporar o clorofórmio para completar o ressecamento no capô à temperatura ambiente. Adicione cinco mililitros de fluido de cintilação ao frasco.
Por fim, analise a radioatividade incorporada à cafeína usando um contador de cintilação. Neste protocolo, o padrão de absorção de cafeína foi analisado via densitometria TLC, através do espectro de luz visível, e leitura em absorção máxima em 273 nanômetros. A curva de separação da cafeína na placa TLC, mostrou um RF entre 0,34 e 0,39.
O RNA derivado de células suspensas exibe separações claras das subunidades RRNA 28s, 18s e 5s, indicando que as amostras eram de alta qualidade. Finalmente, uma curva de derretimento foi obtida a partir da análise QPCR, mostrando um único produto de amplificação para o gene de sinthase de cafeína. Após seu desenvolvimento, essa técnica abriu caminho para pesquisadores das áreas de biotecnologia e bioquímica explorarem a cultura secundária de tecidos metabolizadores a partir do café, chá e coco.
Não se esqueça que trabalhar com radioatividade e patologia molecular pode ser extremamente perigoso, e precauções como o uso de luvas, óculos e equipamentos especiais para material radioativo devem ser sempre tomadas na realização deste procedimento.
