这种方法为将其他病毒抗原引入HVT基因组提供了一种有效的方法，用于快速开发重组疫苗。此技术的一些优点是，GFP 表达式盒首先连接到插入，以便于可视化，然后由 Cre-LoxP 系统删除。同样的方法可用于在HVT基因组的不同位置插入更多的病毒基因，或其他鸟类疱疹病毒用于开发多价重组疫苗。
演示程序将是凯蒂莫法特，细胞排序专家。唐娜，张耀耀和曲广刚，我实验室的科学家。转染前一天准备小鸡胚胎成纤维细胞，如文本协议中概述。
将130万个细胞在2.5毫升的介质中放入六井板的每个井中。根据制造商的说明，使用适当的转染试剂，使用0.5微克的CEF细胞，每组使用0.5微克的Cas9引导RNA质粒，以及1微克的供体质粒。在38.5摄氏度下用5%的二氧化碳孵育细胞12小时。
转染后12小时，用M199培养基稀释HVT病毒存量，浓度为每毫升10万块斑块形成单位。将稀释病毒的130微升添加到转染细胞的每个井中。将未转染细胞的一井设置为阴性对照，并添加相同数量的病毒。
在38.5摄氏度下用5%的二氧化碳孵育细胞三天。在排序前一天，通过在每一个井中播种2万个细胞来准备两个96井板。感染后三天取回含有转染和感染的CEF的六个井板。
从每个井中吸出介质，然后用 PBS 冲洗细胞片。在每个井中加入一毫升0.05%的三辛-EDTA，并在38.5摄氏度下用5%的二氧化碳孵育细胞约5分钟。然后，用50微升FBS重新悬浮细胞，并转移至1.5毫升微离心管。
在重力200倍时离心5分钟。将细胞重新在含有1%FBS的PBS中。使用血细胞计计算细胞数，将细胞密度调整为每毫升一百万个细胞。
接下来，通过其过滤器盖将细胞转移到聚苯乙烯分拣管。使用细胞分拣器将表示 GFP 的单个细胞分拣到预置的 96 孔板中。用分拣的细胞孵育5天，用5%的二氧化碳孵育。
五天后，使用荧光显微镜检查96个井板，并标记含有单个GP阳性斑块的孔。使用 50 微升的 trypsin-EDTA 尝试每个 GFP 阳性良好三分钟。然后，加入50微升培养培养的培养剂，重新悬浮细胞，并将这种悬浮液转移到一个带CEF的六井板井中。
三天后，冷冻冷冻第一代重组病毒中每瓶一瓶。将这些收获的病毒储存在液氮中。从第一代病毒中收集10万个细胞。
在2000转/小时将细胞离心5分钟，然后丢弃上一代。将细胞储存在负20摄氏度，直到准备好进行DNA提取。当准备执行脱氧核糖核酸提取时，使用50微升的压扁缓冲液解冻和重新填充细胞颗粒。
在65摄氏度下将样品在65摄氏度下加热30分钟，然后在95摄氏度下2分钟，使用文本协议中概述的每个DNA样本的一微升，用三个主要结素进行PCR反应。将扩增产品的两微升装到一个1%的加糖凝胶中，用于凝胶电泳。要从重组病毒中去除GFP基因，使用转染试剂将Cre重组酶表达质粒的两微升转染到已预置CEF细胞的六井板中。
转染后12小时从液氮中解冻一小瓶重组病毒。轻轻地将病毒重新暂停，将50微升种子放入转染细胞的每个井中，用相同数量的病毒设置一个和阴性控制。在38.5摄氏度下孵育三天。
感染后72小时准备细胞排序，如前所述。将单个非荧光细胞分拣成 96 井板，预置 CEF。接下来，对所选斑块进行 trypin，并重新发送文本协议中概述的相应单元格。
将一半的细胞进入一个96井板的每个井中，该井板作为第二代用CEF预先播种。将每个克隆的剩余细胞在重力200倍时离心5分钟。丢弃上清液，用50微升的压扁缓冲液重新暂停细胞，用于DNA提取。
然后，使用文本协议中概述的一个微升的 DNA 模板，使用五个主要交汇点底像执行 PCR。根据PCR结果选择三到五个正克隆的重组HVT进一步通过和验证。首先，在预置的24井板中，用第二代重组HVT感染CEF。
感染后48小时去除培养基，在PBS中加入500微升4%甲醛，以修复细胞。在室温下孵育30分钟。接下来，取出固定剂，用 PBS 清洗细胞层三次。
取出PBS，加入500微升0.1%Triton X-100，使细胞渗透。15分钟后用PBS清洗细胞层三次。添加阻塞缓冲区一小时以阻止非特异性绑定。
然后，在阻断缓冲液中稀释原抗体抗VP2单克隆抗体HH7或HVT感染鸡血清1至200。将稀释原抗体的200微升添加到每井中，并在室温下孵育一小时。用 PBS 清洗细胞层三次。
稀释二级抗体山羊抗小鼠IgG亚历克萨568或山羊抗鸡IgG亚历克萨488在1至200在阻尼缓冲液。在每个井中加入200微升稀释的二次抗体，并在室温下孵育一小时。然后，用PBS清洗细胞三次。
使用荧光显微镜检查蛋白质表达。病毒扩张前一天将260万个CEF细胞放入每个T25烧瓶中。解冻至少三个阳性克隆，并添加一瓶细胞或病毒到每个烧瓶。
在38.5摄氏度下用5%的二氧化碳孵育烧瓶，直到观察到50%的细胞病变效应。接下来收获两毫升培养培养的细胞。将 50 微升感染到新的 T25 烧瓶中，该烧瓶与 CEF 细胞一起预置，用于下一代。
继续传递重组病毒至少15代。使用 PCR 分析每一代病毒是否存在 VP2 序列。使用间接免疫荧光分析分析VP2表达的每一代病毒。
单细胞分拣后，通过三个主要结PCR对获得的纯化病毒进行分析，显示预期大小的PCR产品。经过GP记者的切除，由Cre重组超过50%的斑块失去了他们的GP表达。通过单细胞分选获得GP切除后纯化斑块，并由五个主要结PCR进一步确认，该PCR显示预期大小的产品。
然后通过VP2特异性单克隆抗体和抗HVT鸡血清的间接免疫荧光测定确认蛋白质表达。正如预期的那样，感染父母HVT的细胞只能被抗HVT血清染色。而重组HVT感染细胞清楚地显示VP2基因的表达。
要生成重组病毒，需要高转染率，以最大限度地提高病毒和插入器在同一细胞中相遇以进行编辑。按照这个程序，可以进行动物实验，以评估重组疫苗的免疫原性及功效。使用此处描述的CRISPR/Cas9系统平台开发新的多价病媒疫苗，对家禽业预防多种家禽疾病将大有大有大有大益。
