本研究为研究 Th17 细胞的分化提供了标准方案，Th17 细胞是在免疫反应中起关键作用的 T 辅助细胞亚群。通过将向导 RNA 逆转录病毒转导到 Cas9 转基因小鼠的原代 T 细胞中，科学家可以研究基因在调节 Th17 分化中的特定功能。本研究采用 CRISPR-Cas9 技术进行精确的基因编辑，并利用逆转录病毒转导有效靶向原代 T 细胞中的特定基因。
流式细胞术用于评估转导效率和监测细胞分化。进行体外 Th17 极化以刺激 CT4+T 细胞的分化。我们的研究旨在填补对特定基因如何调节 Th17 分化的理解空白。
我们正在使用 CRISPR-Cas9 和逆转录病毒转导，这为传统的基因敲除小鼠模型提供了一种更快、更具成本效益的替代方案。我们的方案不仅详细说明了 CD4 T 细胞的逆转录病毒转导，还为我们的训练 sgRNA 序列和构建质粒提供了全面的指南，这在其他方案中被忽视了。本文概述了实验过程的每个步骤，确保其他研究人员可以轻松复制该方法。
首先，使用 CRISPick 工具设计用于 ROR Gamma T 敲除的单向导 RNA。将参考基因组设置为小鼠 GRCM 38，并根据 CRISPRko 向导系统将 PAM 序列指定为 NGG。在 Quick Gene Lookup 列下的搜索框中输入目标基因名称。
验证系统是否显示正确的基因 ID 和目标基因的全名，以确保选择准确。根据较高的 rank 和 pick 组合顺序，选择一种靶向 RORC 序列的单一向导 RNA，以最大限度地减少脱靶匹配并提高靶向功效。从 Mouse Gecko V2 文库中选择非靶向单向导 RNA 序列。
使用 DNA 聚合酶在 PCR 中使用单向导 RORC 和单向导非靶标编码序列，并使用针对单向导 RNA 和载体序列区域设计的引物。将扩增的序列克隆到 PMXU 6MCS 载体中，将它们放置在带有 mCherry 荧光蛋白的框架中的 U6 启动子和向导 RNA 支架之间。然后设置用于载体构建的 PCR 程序。
转染前一天，将大约 8 倍 10 倍的 6 个 Plat-E 细胞接种在含有补充 10% FBS、青霉素和链霉素的 DMEM 的 10 cm 培养皿中。在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下孵育细胞，直到细胞达到 80% 汇合。转染前 1 小时，用 8 mL 不含酚红、含 5% FBS，但不含青霉素或链霉素的温热还原血清培养基替换细胞培养基。
制备转染混合物 1 和混合物 2。一滴一滴，将 Mix 2 加入 Mix 1 中，然后轻轻混合。将混合物在 15 至 20 摄氏度下孵育 20 至 25 分钟。
在轻轻旋转板的同时，将转染混合物逐滴加入 Plat-E 细胞中。将细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 6 到 12 小时。孵育后，用 10 mL 新鲜细胞培养基更换培养基，并在 37 摄氏度下用 5% 二氧化碳继续孵育 48 小时。
通过使用荧光显微镜检测逆转录病毒载体标签来评估 Plat-E 细胞中的转染效率。接下来，将含病毒的培养上清液在 1， 500G 下离心 10 分钟，以去除细胞碎片。将含病毒的上清液分装到 1 毫升小瓶中。
首先，在 24 孔细胞培养板的每个孔中涂上每毫升 2 微克的抗 CD3 Epsilon 和每毫升 4 微克的抗 CD28，溶于 500 微升 PBS 中。将板包裹在 Parafilm 中并在 4 摄氏度下孵育过夜。收获小鼠脾脏后，使用无菌毛玻璃在 FACS 缓冲液中研磨，以将组织匀浆成单细胞悬液。
通过 70 微米的细胞过滤器将细胞悬液过滤到 50 毫升的试管中。将脾细胞悬液以 800G 离心 5 分钟，然后将沉淀重悬于 2 mL 红细胞裂解缓冲液中。让混合物在室温下静置 5 分钟。
然后加入 FACS 缓冲液，使总体积达到 15 毫升。离心后，将脾细胞重悬于 FACS 缓冲液中，并通过 40 微米细胞过滤器过滤。用 FACS 缓冲液将最终体积调整至 1 毫升，并按照制造商的说明使用商业试剂盒分离 CD4 + T 细胞。
用荧光抗体混合物标记 CD4 + T 细胞。用 FACS 缓冲液洗涤染色细胞后，使用流动池分选仪分离幼稚的 CD4+T 细胞。现在，在去除板结合刺激上清液后，用 500 微升 PBS 冲洗 24 孔板的每个孔两次。
在每个孔的 1 毫升淋巴细胞培养基中，以 6 次幂的 6 种幼稚 CD4+T 细胞的 1 倍进行铺板，孵育 18 至 24 小时。第二天，将活化的细胞收集到 1.5 毫升试管中，并以 800G 离心 5 分钟。将细胞沉淀重悬于 1 毫升感染混合物中，并将 1 毫升混合物添加到 48 孔板的孔中。
用 Parafilm 包裹板，在 800 摄氏度下以 32G 离心 90 分钟，加速和减速设置为 3。离心后，取出封口膜并将细胞孵育 4 小时。为了制备抗原呈递细胞或 APC，在 15 毫升试管中将脾细胞重悬于一毫升淋巴细胞培养基中，每毫升含 50 μg 丝裂霉素。
将脾细胞在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳中孵育 1 小时。接下来，将 PBS 加入至 15 毫升标记处，并以 800G 离心 5 分钟。将脾细胞重悬于 1 毫升淋巴细胞培养基中，并在细胞计数仪上计数细胞数。
逆转录病毒感染后，将转导的 CD4+T 细胞离心在 1.5 毫升试管中，并将感染细胞重悬于 600 微升 PBS 中。将 0.5 乘以 10 倍转导的 CD4+T 细胞置于 1 毫升淋巴细胞培养基中，将 1.5 倍 10 倍的 6 个 APC 细胞置于 24 孔细胞培养板的孔中。补充每毫升 2 μg 抗 CD3 Epsilon、每毫升 2 μg 抗 CD28 和 Th17 分化混合物。
在 37 摄氏度和 5% 二氧化碳下将细胞培养两天。两天后，将细胞悬液离心在 1.5 mL试管中，并将沉淀重悬于1 mL淋巴细胞培养基中，该培养基中含有每毫升 3 ng TGF β 和 30 ng/mL 白细胞介素 6。将细胞转移到 24 孔板的孔中两天。
在 24 孔板的新孔中，用 50 ng/ml PMA、500 ng/mL 离子霉素和 5 μg/ml brefelden A 在 500 μL 淋巴细胞培养基中处理分化的细胞。将细胞在 37 摄氏度下孵育 4 小时。将处理过的细胞收集到含有 1 毫升 FACS 缓冲液的 1.5 毫升试管中。
离心后，用含有荧光抗体混合物的 PBS 在 4 摄氏度下对细胞进行染色 30 分钟。用 300 微升 PBS 洗涤染色细胞，然后用 300 微升 2% 磷酸盐缓冲甲醛在 4 摄氏度下固定 60 分钟。用 PBS 洗涤细胞后，将其重悬于 600 μL 透化缓冲液中，并以 800G 离心 5 分钟。
在室温下，用抗白细胞介素 17A 抗体在 100 μL 透化缓冲液中对细胞进行染色 60 分钟。如 mCherry 阳性细胞所示，逆转录病毒感染效率约为 40%Th17 分化效率在用靶向 ROR Gamma T 基因的单一向导 RNA 处理的细胞中显著降低。在用单向导 RNA RORC 处理的细胞中，RORC 和白细胞介素 17A 的表达水平显著降低。
