Этот подход предлагает эффективный способ внедрения других вирусных антигенов в геном HVT для быстрого развития рекомбинантных вакцин. Некоторое преимущество этого метода заключается в том, что кассета с выражением GFP крепится к вставке сначала для легкой визуализации, а затем удаляется системой Cre-LoxP. Тот же подход может быть использован для вставки более вирусных генов в разных местах генома HVT, или других вирусов птичьего герпеса для разработки многовалентных рекомбинантных вакцин.
Демонстрацией процедуры будет Кэти Моффат, эксперт по сортировке клеток. На Тан, Яояо Чжан и Гуанган Цюэ, ученые из моей лаборатории. За день до трансфекции приготовьте фибробласты эмбриона цыпленка, как указано в текстовом протоколе.
Семя 1,3 миллиона клеток в 2,5 миллилитров среды в каждый колодец из шести пластин хорошо. Transfect CEF клетки с 0,5 микрограммов каждый из двух Cas9 руководство РНК плазмидов, и один микрограмм донорской плазмиды с использованием соответствующих реагентов трансфекции в соответствии с инструкциями производителя. Инкубировать клетки при 38,5 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение 12 часов.
12 часов после трансфекции разбавить запас вируса HVT с M199 культуры среды до концентрации 100000 доска формирования единиц на миллилитр. Добавьте 130 микролитров разбавленного вируса в каждую колодец трансфицированных клеток. Установите один колодец нетрансфицированных клеток в качестве отрицательного контроля и добавьте такое же количество вируса.
Инкубировать клетки при 38,5 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение трех дней. За день до сортировки приготовьте две пластины 96 хорошо, посеять 20 000 клеток в каждую колодец. Через три дня после заражения получить шесть пластин хорошо, содержащих трансфицированных и инфицированных CEFs.
Аспирировать среды из каждой хорошо и промыть лист клетки с PBS. Добавьте один миллилитр 0,05%трипсина-ЭДТА к каждой хорошо и инкубировать клетки при 38,5 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение примерно пяти минут. Затем, повторного перерасхода клеток с 50 микролитров FBS и передать эту подвеску в 1,5 миллилитров микроцентрифуг трубки.
Центрифуга при 200-времени гравитации в течение пяти минут. Повторное распределение клеток в одном миллилитре PBS, содержащем 1%FBS. Используйте гемоцитометр, чтобы подсчитать клетки и настроить плотность клеток до одного миллиона клеток на миллилитр.
Затем перенесите клетки в сортированную трубку из полистирола через крышку ситечко. Используя сортер ячейки сортировать одиночные клетки, выражаюющие GFP в предварительной 96 пластины хорошо. Инкубировать пластины с отсортированных клеток на 38,5 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа в течение пяти дней.
Через пять дней используйте флуоресцентный микроскоп, чтобы проверить 96 пластин скважин и отметить скважины, которые содержат один положительный налет GFP. Трипсинизировать каждый GFP положительный хорошо с 50 микролитров трипсина-ЭДТА в течение трех минут. Затем добавьте 50 микролитров культурной среды, чтобы повторно использовать клетки и перенести эту суспензию в один колодец из шести пластин с CEFs.
Через три дня заморозить один флакон каждого из первого поколения рекомбинантных вирусов в замораживании среды. Храните эти собранные вирусы в жидком азоте. Соберите 100 000 клеток с каждого из первого поколения вирусов.
Центрифугировать клетки при 2000 об/мин в течение пяти минут, и отказаться от супернатанта. Храните клетки при отрицательном 20 градусов по Цельсию до готовности к проведению экстракции ДНК. При готовности к проведению извлечения ДНК используйте 50 микролитров хлюпающих буферов для размораживания и повторного перерасхода клеточных гранул.
Lyse образцы при 65 градусах по Цельсию в течение 30 минут, а затем при 95 градусах по Цельсию в течение двух минут, чтобы инактивировать Proteinase K.Perform реакции ПЦР с тремя премьер-соединения грунтовки с использованием одного микролитр каждого образца ДНК, как указано в текстовом протоколе. Загрузите два микролитера продуктов усиления в одну колодец 1%agarose гель для гель электрофорез. Чтобы удалить ген GFP из рекомбинантного вируса, используйте трансфектический реагент для трансинфекции двух микролитров плазмидной экспрессии Cre recombinase в шести хорошо пластины, которая была предварительно сеяной с клетками CEF.
Через 12 часов после трансфекции разморажируй один флакон рекомбинантного вируса из жидкого азота. Аккуратно повторного распространения вируса и семян 50 микролитров в каждой колодец трансфицированных клеток, установив один, а также отрицательный контроль с тем же количеством вируса. Инкубация при 38,5 градусах по Цельсию в течение трех дней.
72 часов после инфекции подготовить клетки для сортировки, как описано ранее. Сортировать одиночные нефлуоресцентные клетки в 96 хорошо пластины предварительно с CEFs. Далее попробуйте прорисовать выбранные бляшки и повторно помесить соответствующие ячейки, изложенные в текстовом протоколе.
Перейти половину клеток в каждый колодец 96 пластины, которая была preseeded с CEFs как второе поколение. Центрифуга оставшихся клеток каждого клона при 200-м раз больше гравитации в течение пяти минут. Отбросьте супернатант и заново посовещайте клетки 50 микролитров хлюпающих буферов для извлечения ДНК.
Затем выполните ПЦР с пятью праймерами для соединения, используя один микролитр шаблона ДНК, изложенный в текстовом протоколе. По результатам ПЦР выберите от трех до пяти положительных клонов рекомбинантного HVT для дальнейших проходов и проверки. Во-первых, заразить CEFs со вторым поколением рекомбинантных HVT в предварительной пластине 24 хорошо.
Через 48 часов после заражения удалить культуру среды и добавить 500 микролитров 4%paraformaldehyde в PBS, чтобы исправить клетки. Инкубировать при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем удалите фиксатор и трижды промыте клеточный слой с помощью PBS.
Удалите PBS и добавьте 500 микролитров 0.1%Triton X-100 для проницаемой клетки. После 15 минут мыть слой клетки три раза с PBS. Добавьте блокирующий буфер в течение одного часа, чтобы заблокировать неспецифическую привязку.
Затем разбавить первичное антитело анти-VP2 моноклональных антител HH7 или HVT-инфицированных куриной сыворотки на один до 200 в блокировании буфера. Добавьте 200 микролитров разбавленного первичного антитела к каждой хорошо и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа. Вымойте слой клетки три раза с ПОМОЩЬю PBS.
Разбавить вторичное антитело козы анти-мышь IgG Alexa 568 или коза анти-куриный IgG Alexa 488 на один до 200 в блокировании буфера. Добавьте 200 микролитров разбавленных вторичных антител к каждому колодец и инкубировать при комнатной температуре в течение одного часа. Затем, мыть клетки три раза с PBS.
Используйте флуоресцентный микроскоп, чтобы проверить экспрессию белка. За день до распространения вируса семя 2,6 миллиона клеток CEF в каждой колбе T25. Оттепель по крайней мере три положительных клонов и добавить один флакон клеток или вирусов в каждой колбе.
Инкубировать колбы при 38,5 градусов по Цельсию с 5%углекислого газа до 50%цитопатический эффект наблюдается. Следующий урожай клеток в двух миллилитров культуры среды. Заразите 50 микролитров новой колбой T25, которая была засеяна клетками CEF для следующего поколения.
Продолжайте передавать рекомбинантный вирус, по крайней мере 15 поколений. Использование ПЦР анализировать каждое поколение вирусов на наличие vp2 последовательности. Используя косвенный анализ иммунофлуоресценции, проанализируйте каждое поколение вирусов экспрессии VP2.
После сортировки одной клетки полученный очищенный вирус анализируется тремя главными соединениями ПЦР, на которых показан продукт ПЦР ожидаемого размера. После иссечения репортера GFP Cre рекомбиназы более 50% бляшек потеряли свое выражение GFP. Очищенный налет после иссечения GFP получается одноклеточной сортировкой и дополнительно подтверждается пятью премьер-соединения ПЦР, который показывает продукт ожидаемого размера.
Выражение белка затем подтверждается косвенным иммунофлуоресценции анализа с VP2 конкретных моноклональных антител и анти-HVT куриной сыворотки. Как и ожидалось, клетки, инфицированные родительской HVT может быть окрашены только анти-HVT сыворотки. В то время как рекомбинантные HVT инфицированные клетки ясно показывают экспрессию гена VP2.
Для создания рекомбинантного вируса требуется высокая скорость трансинфекции, чтобы максимизировать вероятность заражения вирусом и вставки, чтобы встретиться в той же клетке для редактирования. После этой процедуры можно проводить эксперименты на животных для оценки иммуногенности и эффективности рекомбинантных вакцин. Разработка новых многовалентных векторных вакцин с использованием описанной здесь платформы системы CRISPR/Cas9 будет весьма полезной для птицеводческой промышленности для защиты от многочисленных болезней домашней птицы.
