Dieser Ansatz bietet eine effiziente Möglichkeit, andere virale Antigene in das HVT-Genom einzuführen, um eine schnelle Entwicklung rekombinanter Impfstoffe zu erhalten. Ein Vorteil dieser Technik besteht darin, dass eine GFP-Expressionskassette zur einfachen Visualisierung zuerst an der Einlage befestigt und dann vom Cre-LoxP-System entfernt wird. Derselbe Ansatz kann verwendet werden, um mehr virale Gene an verschiedenen Stellen des HVT-Genoms oder andere Vogelherpesviren für die Entwicklung multivalenter rekombinanter Impfstoffe einzufügen.
Die Untersuchung des Verfahrens wird Katy Moffat, expertin für Zellsortierung, zeigen. Na Tang, Yaoyao Zhang und Guanggang Qu, Wissenschaftler aus meinem Labor. Am Tag vor der Transfektion bereiten Küken Embryo Fibroblasten, wie im Textprotokoll beschrieben.
Samen 1,3 Millionen Zellen in 2,5 Milliliter Medium in jeden Brunnen einer sechs Brunnenplatte. Transfekte die CEF-Zellen mit jeweils 0,5 Mikrogramm der beiden Cas9-Führungs-RNA-Plasmide und einem Mikrogramm des Spenderplasmids mit einem geeigneten Transfektionsreagenz gemäß den Anweisungen des Herstellers. Inkubieren Sie die Zellen bei 38,5 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für 12 Stunden.
12 Stunden nach der Transfektion verdünnen sie den HVT-Virusbestand mit dem M199-Kulturmedium auf eine Konzentration von 100.000 Plaquebildenden Einheiten pro Milliliter. Fügen Sie 130 Mikroliter des verdünnten Virus zu jedem Brunnen der transfizierten Zellen hinzu. Legen Sie einen Brunnen von nicht transfizierten Zellen als negative Kontrolle und fügen Sie die gleiche Menge an Virus hinzu.
Inkubieren Sie die Zellen bei 38,5 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für drei Tage. Am Tag vor der Sortierung bereiten Sie zwei 96 Brunnenplatten vor, indem Sie jeweils 20.000 Zellen in jeden Brunnen säen. Drei Tage nach der Infektion holen Sie die sechs Brunnenplatten, die die transfizierten und infizierten CEFs enthalten.
Saugen Sie das Medium aus jedem Brunnen und spülen Sie das Zellblatt mit PBS ab. Fügen Sie jeweils einen Milliliter 0,05% Trypsin-EDTA zu jedem Brunnen hinzu und bebrüten die Zellen bei 38,5 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für etwa fünf Minuten. Dann setzen Sie die Zellen mit 50 Mikroliter FBS wieder auf und übertragen Sie diese Suspension in ein 1,5 Milliliter Mikrozentrifugenrohr.
Zentrifuge bei 200-facher Schwerkraft für fünf Minuten. Setzen Sie die Zellen in einem Milliliter PBS mit 1%FBS wieder aus. Verwenden Sie ein Hämozytometer, um die Zellen zu zählen und die Zelldichte auf eine Million Zellen pro Milliliter anzupassen.
Als nächstes übertragen Sie die Zellen über ihre Siebkappe in ein Polystyrol-Sortierrohr. Mit einem Zellsortierer sortieren sie die einzelnen Zellen, die GFP exemiten, in die voreingestellten 96 Brunnenplatten. Inkubieren Sie die Platten mit den sortierten Zellen bei 38,5 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid für fünf Tage.
Nach fünf Tagen überprüfen Sie mit dem Fluoreszenzmikroskop die 96 Brunnenplatten und markieren Sie die Brunnen, die eine einzige GFP-positive Plaque enthalten. Versuchen Sie jedes GFP positiv gut mit 50 Mikroliter Trypsin-EDTA für drei Minuten. Dann fügen Sie 50 Mikroliter Kulturmedium, um die Zellen wieder auszusetzen und übertragen Sie diese Suspension in einen Brunnen von sechs Brunnenplatte mit CEFs.
Nach drei Tagen frieren Sie eine Durchstechflasche jeder der ersten Generation rekombinanter Viren im Gefriermedium ein. Bewahren Sie diese geernteten Viren in flüssigem Stickstoff auf. Sammeln Sie 100.000 Zellen aus jeder der ersten Generation von Viren.
Zentrifugieren Sie die Zellen fünf Minuten lang bei 2.000 U/min und entsorgen Sie den Überstand. Bewahren Sie die Zellen bei negativen 20 Grad Celsius auf, bis sie bereit sind, die DNA-Extraktion durchzuführen. Wenn sie bereit sind, die DNA-Extraktion durchzuführen, verwenden Sie 50 Mikroliter Squishing-Puffer, um die Zellpellets aufzutauen und wieder aufzuhängen.
Lyse die Proben bei 65 Grad Celsius für 30 Minuten und dann bei 95 Grad Celsius für zwei Minuten, um die Proteinase K.Perform eine PCR-Reaktion mit drei Prime Junction Primer mit einem Mikroliter jeder DNA-Probe, wie im Textprotokoll beschrieben. Zwei Mikroliter der Amplifikationsprodukte auf einen Brunnen von 1%Agarose-Gel für die Gelelektrophorese laden. Um das GFP-Gen aus dem rekombinanten Virus zu entfernen, verwenden Sie ein Transfektionsreagenz, um zwei Mikroliter Cre-Rekombinatog-Expressionsplasmid in die sechs Brunnenplatte zu transfezieren, die mit CEF-Zellen voreingestellt wurde.
12 Stunden nach der Transfektion tauen eine Durchstechflasche mit rekombinantem Virus aus flüssigem Stickstoff auf. Setzen Sie das Virus vorsichtig wieder aus und säen Sie 50 Mikroliter in jeden Brunnen transfizierter Zellen, wobei sie eine sowie die negative Kontrolle mit der gleichen Menge an Virus einstellen. Drei Tage lang bei 38,5 Grad Celsius inkubieren.
72 Stunden nach der Infektion bereiten die Zellen für die Sortierung wie zuvor beschrieben. Sortieren Sie die einzelnen nicht fluoreszierenden Zellen in eine 96-Well-Platte, die mit CEFs voreingestellt ist. Als Nächstes versuchen Sie, die ausgewählten Plaques zu verwenden, und setzen Sie die entsprechenden Zellen wie im Textprotokoll beschrieben erneut aus.
Übergeben Sie die Hälfte der Zellen in jeden Brunnen einer 96-Well-Platte, die mit CEFs als zweite Generation voreingestellt wurde. Zentrifugieren Sie die verbleibenden Zellen jedes Klons mit 200-facher Schwerkraft für fünf Minuten. Entsorgen Sie den Überstand und setzen Sie die Zellen mit 50 Mikrolitern Squishing-Puffer für die DNA-Extraktion wieder aus.
Führen Sie dann PCR mit fünf Prime Junction Primern mit einem Mikroliter DNA-Vorlage aus, wie im Textprotokoll beschrieben. Basierend auf den PCR-Ergebnissen wählen Sie drei bis fünf positive Klone rekombinanter HVT für weitere Passagen und Verifizierung. Infizieren Sie CEFs zunächst mit der zweiten Generation rekombinanter HVT in einer voreingestellten 24-Well-Platte.
48 Stunden nach der Infektion entfernen Sie das Kulturmedium und fügen Sie 500 Mikroliter 4%Paraformaldehyd in PBS hinzu, um die Zellen zu fixieren. Bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubieren. Entfernen Sie anschließend das Fixativ und waschen Sie die Zellschicht dreimal mit PBS.
Entfernen Sie die PBS und fügen Sie 500 Mikroliter 0,1%Triton X-100 hinzu, um die Zellen zu permeabilisieren. Nach 15 Minuten die Zellschicht dreimal mit PBS waschen. Fügen Sie den Blockierungspuffer für eine Stunde hinzu, um die unspezifische Bindung zu blockieren.
Anschließend den primären Antikörper-VP2-Monoklon-Antikörper HH7 oder HVT-infiziertes Hühnerserum bei einem bis 200 im Blockierpuffer verdünnen. Fügen Sie 200 Mikroliter des verdünnten Primärantikörpers zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde. Waschen Sie die Zellschicht dreimal mit PBS.
Verdünnen Sie den sekundären Antikörper Ziege Anti-Maus IgG Alexa 568 oder Ziege Anti-Huhn IgG Alexa 488 bei einem bis 200 in Blockierpuffer. Fügen Sie 200 Mikroliter verdünnten Sekundärantikörper zu jedem Brunnen hinzu und inkubieren Sie bei Raumtemperatur für eine Stunde. Dann waschen Sie die Zellen dreimal mit PBS.
Verwenden Sie das Fluoreszenzmikroskop, um die Proteinexpression zu überprüfen. Am Tag vor der Virusexpansion samen 2,6 Millionen CEF-Zellen in jeden T25-Kolben. Mindestens drei positive Klone auftauen und jedem Kolben eine Durchstechflasche mit Zellen oder Viren hinzufügen.
Inkubieren Sie die Kolben bei 38,5 Grad Celsius mit 5% Kohlendioxid, bis eine 50%zytopathische Wirkung beobachtet wird. Als nächstes ernten Sie die Zellen in zwei Milliliter Kulturmedium. Infizieren Sie 50 Mikroliter in einen neuen T25-Kolben, der für die nächste Generation mit CEF-Zellen voreingestellt wurde.
Halten Sie das rekombinante Virus für mindestens 15 Generationen. Analysieren Sie mithilfe von PCR jede Virengeneration auf das Vorhandensein der VP2-Sequenz. Mit Hilfe eines indirekten Immunfluoreszenz-Assays wird jede Generation von Viren der VP2-Expression analysiert.
Nach der Einzelzellsortierung wird das erhaltene gereinigte Virus mit drei Prime Junction PCR analysiert, die ein PCR-Produkt der erwarteten Größe zeigt. Nach der Exzision des GFP-Reporters durch Cre Recombinase verloren über 50% der Plaques ihren GFP-Ausdruck. Die gereinigte Plaque nach der GFP-Exzision wird durch Einzelzellsortierung erhalten und wird durch fünf Prim-Knoten-PCR bestätigt, die ein Produkt der erwarteten Größe zeigen.
Die Proteinexpression wird dann durch indirekten Immunfluoreszenz-Assay mit VP2-spezifischem monoklonalen Antikörper und Anti-HVT-Hühnerserum bestätigt. Wie erwartet können Zellen, die mit dem elterlichen HVT infiziert sind, nur mit Anti-HVT-Serum gefärbt werden. Während rekombinante HVT-infizierte Zellen deutlich die Expression des VP2-Gens zeigen.
Um ein rekombinantes Virus zu erzeugen, ist eine hohe Transfektionsrate erforderlich, um die Wahrscheinlichkeit des Virus zu maximieren und der Einsatz in derselben Zelle zu treffen, damit die Bearbeitung stattfinden kann. Im Anschluss an dieses Verfahren können Tierversuche durchgeführt werden, um die Immunogenität und Wirksamkeit der rekombinanten Impfstoffe zu bewerten. Die Entwicklung neuer multivalenter Vektorimpfstoffe mit der hier beschriebenen CRISPR/Cas9-Systemplattform wird für die Geflügelindustrie sehr vorteilhaft sein, um sich vor mehreren Geflügelkrankheiten zu schützen.
