Este enfoque ofrece una manera eficiente de introducir otros antígenos virales en el genoma de HVT para el desarrollo rápido de vacunas recombinantes. Una ventaja de esta técnica es que un casete de expresión GFP se une primero a la plaquita para facilitar la visualización y luego se elimina mediante el sistema Cre-LoxP. El mismo enfoque se puede utilizar para insertar más genes virales en diferentes lugares del genoma del HVT, u otros virus del herpes aviar para el desarrollo de vacunas recombinantes multivalentes.
Demostrando el procedimiento estará Katy Moffat, una experta en clasificación celular. Na Tang, Yaoyao Zhang y Guanggang Qu, científicos de mi laboratorio. El día antes de la transfección preparar fibroblastos embrionarios de polluelo como se describe en el protocolo de texto.
Siembra 1,3 millones de células en 2,5 mililitros de medio en cada pozo de una placa de seis pozos. Transfeque las células CEF con 0,5 microgramos cada uno de los dos plásmidos guía cas9 de ARN, y un microgramo del plásmido del donante utilizando un reactivo de transfección adecuado de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Incubar las células a 38,5 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante 12 horas.
12 horas después de la transfección diluir el stock de virus HVT con un medio de cultivo M199 a una concentración de 100.000 unidades formadoras de placa por mililitro. Añadir 130 microlitros del virus diluido a cada pozo de células trans infectadas. Establezca un pozo de células no infectadas como control negativo y agregue la misma cantidad de virus.
Incubar las células a 38,5 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante tres días. El día antes de la clasificación preparar dos placas de 96 pozos mediante la siembra de 20.000 células en cada pozo. Tres días después de la infección recuperar las seis placas de pozo que contienen los CEF trans infectados e infectados.
Aspirar el medio de cada pozo y enjuagar la hoja de la célula con PBS. Añadir un mililitro de 0.05%trypsin-EDTA a cada pozo e incubar las células a 38.5 grados Celsius con 5% de dióxido de carbono durante aproximadamente cinco minutos. Luego, resuspender las células con 50 microlitros de FBS y transferir esta suspensión a un tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros.
Centrifugar a 200 veces la gravedad durante cinco minutos. Resuspender las células en un mililitro de PBS que contiene 1%FBS. Utilice un hemocitociómetro para contar las células y ajustar la densidad celular a un millón de células por mililitro.
A continuación, transfiera las células a un tubo de clasificación de poliestireno a través de su tapa de colador. Usando un clasificador de celdas ordene las celdas individuales que expresan la GFP en las placas de 96 pozos preseleccionadas. Incubar las placas con las células ordenadas a 38,5 grados Centígrados con un 5% de dióxido de carbono durante cinco días.
Después de cinco días utilice el microscopio de fluorescencia para comprobar las 96 placas de pozo y marcar los pozos que contienen una sola placa positiva GFP. Pruebe cada GFP positivo bien con 50 microlitros de trippsina-EDTA durante tres minutos. A continuación, añadir 50 microlitros de medio de cultivo para resuspend las células y transferir esta suspensión en un pozo de una placa de seis pozos con CEF.
Después de tres días congelar un vial de cada una de las primeras generaciones de virus recombinantes en medio de congelación. Almacene estos virus cosechados en nitrógeno líquido. Recoge 100.000 células de cada una de la primera generación de virus.
Centrifugar las células a 2.000 rpm durante cinco minutos, y desechar el sobrenadante. Almacene las células en 20 grados Celsius negativos hasta que estén listas para realizar la extracción de ADN. Cuando esté listo para realizar la extracción de ADN, utilice 50 microlitros de tampón de aplastamiento para descongelar y resuspender los gránulos celulares.
Lisar las muestras a 65 grados Celsius durante 30 minutos y luego a 95 grados Celsius durante dos minutos para inactivar la Proteinase K.Realizar una reacción PCR con tres imprimaciones de unión primo utilizando un microlitro de cada muestra de ADN como se describe en el protocolo de texto. Cargue dos microlitros de los productos de amplificación en un pocódi de 1% de gel de agarosa para electroforesis de gel. Para eliminar el gen GFP del virus recombinante, utilice un reactivo de transfección para transfecar dos microlitros de plásmido de expresión recombinasa de Cre en la placa de seis pozos que se ha preseleccionado con células CEF.
12 horas después de la descongelación de la transfección un vial de virus recombinante a partir de nitrógeno líquido. Resuspender suavemente el virus y sembrar 50 microlitros en cada pozo de células trans infectadas, estableciendo uno bien como el control negativo con la misma cantidad de virus. Incubar a 38,5 grados centígrados durante tres días.
72 horas después de la infección preparar las células para la clasificación como se describió anteriormente. Ordene las células no fluorescentes individuales en una placa de 96 pozos preseleccionada con CEF. A continuación, pruebe las placas elegidas y resusppend las celdas correspondientes como se describe en el protocolo de texto.
Pasar la mitad de las células en cada pozo de una placa de 96 pozos que ha sido preseleccionada con CEF como la segunda generación. Centrifugar las células restantes de cada clon a 200 veces la gravedad durante cinco minutos. Deseche el sobrenadante y resusppend las células con 50 microlitros de tampón de aplastamiento para la extracción de ADN.
A continuación, realice pcR con cinco imprimaciones de unión principales utilizando un microlitro de plantilla de ADN como se describe en el protocolo de texto. Sobre la base de los resultados de la PCR, elija de tres a cinco clones positivos de HVT recombinante para pasajes y verificación adicionales. En primer lugar, infectar los CEF con la segunda generación de HVT recombinante en una placa de 24 pozos preseleccionada.
48 horas después de la infección eliminar el medio de cultivo y añadir 500 microlitros de 4%paraformaldehído en PBS para fijar las células. Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos. A continuación, retire el fijador y lave la capa celular tres veces con PBS.
Retire el PBS y agregue 500 microlitros de 0.1%Triton X-100 para permeabilizar las células. Después de 15 minutos, lave la capa celular tres veces con PBS. Agregue el búfer de bloqueo durante una hora para bloquear el enlace no específico.
A continuación, diluya el anticuerpo primario anti-VP2 anticuerpo monoclonal HH7 o suero de pollo infectado por HVT a uno a 200 en el tampón de bloqueo. Añadir 200 microlitros del anticuerpo primario diluido a cada pozo e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Lave la capa celular tres veces con PBS.
Diluir el anticuerpo secundario cabra anti-ratón IgG Alexa 568 o cabra anti-pollo IgG Alexa 488 en uno a 200 en tampón de bloqueo. Añadir 200 microlitros de anticuerpos secundarios diluidos a cada pozo e incubar a temperatura ambiente durante una hora. Luego, lave las células tres veces con PBS.
Utilice el microscopio de fluorescencia para comprobar la expresión de la proteína. El día antes de la expansión del virus sembra 2,6 millones de células CEF en cada matraz T25. Descongelar al menos tres clones positivos y añadir un vial de células o virus a cada matraz.
Incubar los matraces a 38,5 grados celsius con un 5% de dióxido de carbono hasta que se observe un efecto citopático del 50%. A continuación, cosechar las células en dos mililitros de medio de cultivo. Infectar 50 microlitros a un nuevo matraz T25 que fue preseleccionado con células CEF para la próxima generación.
Sigue transmitiendo el virus recombinante durante al menos 15 generaciones. Usando PCR analiza cada generación de virus para la presencia de la secuencia VP2. Utilizando un ensayo indirecto de inmunofluorescencia analiza cada generación de virus de expresión VP2.
Después de la clasificación de una sola célula, el virus purificado obtenido es analizado por tres PCR de unión principal, que muestra un producto PCR del tamaño esperado. Después de la escisión del reportero de GFP por Cre recombinar más del 50% de las placas perdieron su expresión de GFP. La placa purificada después de la escisión de la GFP se obtiene mediante la clasificación de una sola célula y se confirma además con cinco PCR de unión principal que muestra el producto del tamaño esperado.
La expresión de la proteína se confirma entonces mediante un ensayo indirecto de inmunofluorescencia con anticuerpo monoclonal específico VP2 y suero de pollo anti-HVT. Como era de esperar, las células infectadas con el HVT parental sólo pueden ser manchadas por suero anti-HVT. Mientras que las células infectadas por HVT recombinantes muestran claramente la expresión del gen VP2.
Para generar un virus recombinante se requiere una alta tasa de transfección para maximizar la posibilidad del virus y la inserción para reunirse en la misma celda para que la edición tenga lugar. Después de este procedimiento se pueden realizar experimentos con animales para evaluar la inmunogenicidad y la eficacia de las vacunas recombinantes. El desarrollo de nuevas vacunas vectoriales multivalentes utilizando la plataforma del sistema CRISPR/Cas9 descrita aquí será muy beneficioso para la industria avícola para proteger contra múltiples enfermedades avícolas.
