Esta abordagem oferece uma maneira eficiente de introduzir outros antígenos virais no genoma HVT para o rápido desenvolvimento de vacinas recombinantes. Alguma vantagem desta técnica é que um de expressão GFP é anexado à inserção primeiro para fácil visualização e depois removido pelo sistema Cre-LoxP. A mesma abordagem pode ser usada para inserir mais genes virais em diferentes locais do genoma HVT, ou outros vírus herpes aviários para o desenvolvimento de vacinas recombinantes multivalentes.
Demonstrando o procedimento será Katy Moffat, uma especialista em triagem celular. Na Tang, Yaoyao Zhang e Guanggang Qu, cientistas do meu laboratório. Um dia antes da transfecção, preparem os fibroblastos de embrião de filhotes, conforme descrito no protocolo de texto.
Semente 1,3 milhões de células em 2,5 mililitros de médio em cada poço de uma placa de seis poços. Transfeito as células CEF com 0,5 microgramas cada um dos dois plasmídeos RNA guia Cas9, e um micrograma do plasmídeo doador usando um reagente de transfecção apropriado de acordo com as instruções do fabricante. Incubar as células a 38,5 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por 12 horas.
12 horas após a transfecção dilui o estoque do vírus HVT com média de cultura M199 para uma concentração de 100.000 unidades formadoras de placas por mililitro. Adicione 130 microliters do vírus diluído a cada poço de células transfeinadas. Coloque um poço de células não traduzindo como um controle negativo e adicione a mesma quantidade de vírus.
Incubar as células a 38,5 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por três dias. Um dia antes da triagem, prepare duas placas de 96 poços semeando 20.000 células em cada poço. Três dias após a infecção recuperam as seis placas do poço contendo os CEFs transfectados e infectados.
Aspire o meio de cada poço e enxágue a folha celular com PBS. Adicione um mililitro de 0,05% de trippsina-EDTA a cada poço e incuba as células a 38,5 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por aproximadamente cinco minutos. Em seguida, resuspengue as células com 50 microliters de FBS e transfira esta suspensão para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro.
Centrifugar a 200 vezes a gravidade por cinco minutos. Resuspend as células em um mililitro de PBS contendo 1%FBS. Use um hemótmetro para contar as células e ajustar a densidade celular para um milhão de células por mililitro.
Em seguida, transfira as células para um tubo de triagem de poliestireno através de sua tampa de coador. Usando um classificador de células, classifique as células únicas expressando GFP nas placas de poços de 96 semeadas. Incubar as placas com as células classificadas a 38,5 graus Celsius com 5% de dióxido de carbono por cinco dias.
Após cinco dias use o microscópio de fluorescência para verificar as 96 placas do poço e marcar os poços que contêm uma única placa positiva GFP. Trypsinize cada GFP positivo bem com 50 microliters de trypsin-EDTA por três minutos. Em seguida, adicione 50 microliters de cultura média para resuspensar as células e transferir esta suspensão para um poço de uma placa de seis poços com CEFs.
Após três dias congele um frasco de cada uma das primeiras gerações de vírus recombinantes em meio de congelamento. Armazene esses vírus colhidos em nitrogênio líquido. Coletar 100.000 células de cada uma das primeiras gerações de vírus.
Centrifugar as células a 2.000 rpm por cinco minutos, e descartar o supernatante. Armazene as células a 20 graus Celsius negativos até que estejam prontas para realizar a extração de DNA. Quando estiver pronto para realizar a extração de DNA use 50 microliters de tampão de squishing para descongelar e resuspensar as pelotas celulares.
Lyse as amostras a 65 graus Celsius por 30 minutos e depois a 95 graus Celsius por dois minutos para inativar o Proteinase K.Executar uma reação pcr com três primers de junção principais usando um microliter de cada amostra de DNA como descrito no protocolo de texto. Carregue dois microliters dos produtos de amplificação para um poço de gel de 1%agarose para eletroforese gel. Para remover o gene GFP do vírus recombinante, use um reagente de transfecção para transfetar dois microlitadores de expressão de recombinase cre plasmid na placa de seis poços que foi pré-disseeded com células CEF.
12 horas após a transfecção descongelam um frasco de vírus recombinante de nitrogênio líquido. Resuspenque suavemente o vírus e semee 50 microliters em cada poço de células transfeinadas, estabelecendo um bem como o controle negativo com a mesma quantidade de vírus. Incubar a 38,5 graus Celsius por três dias.
72 horas após a infecção preparam as células para a classificação como descrito anteriormente. Classifique as células não fluorescentes únicas em uma placa de 96 poços pré-semeadas com CEFs. Em seguida, tentepsinizar as placas escolhidas e resususpensar as células correspondentes conforme descrito no protocolo de texto.
Passe metade das células em cada poço de uma placa de 96 poços que foi pré-semeada com CEFs como a segunda geração. Centrifugar as células restantes de cada clone a 200 vezes a gravidade por cinco minutos. Descarte o supernascer e resuspenque as células com 50 microliters de tampão de esguicho para extração de DNA.
Em seguida, execute o PCR com cinco primers de junção prime usando um microliter de modelo de DNA como descrito no protocolo de texto. Com base nos resultados do PCR, escolha de três a cinco clones positivos de HVT recombinante para novas passagens e verificação. Primeiro, infecte CEFs com a segunda geração de HVT recombinante em uma placa de 24 poços pré-semeada.
48 horas após a infecção remover o meio de cultura e adicionar 500 microliters de 4% de paraformaldeído em PBS para corrigir as células. Incubar em temperatura ambiente por 30 minutos. Em seguida, remova o fixador e lave a camada celular três vezes com PBS.
Remova o PBS e adicione 500 microliters de 0,1% Triton X-100 para permeabilizar as células. Após 15 minutos, lave a camada celular três vezes com PBS. Adicione o buffer de bloqueio por uma hora para bloquear a vinculação inespecífica.
Em seguida, diluir o anticorpo monoclonal anti-VP2 primário HH7 ou soro de frango infectado por HVT em um a 200 no tampão de bloqueio. Adicione 200 microliters do anticorpo primário diluído a cada poço e incubar à temperatura ambiente por uma hora. Lave a camada celular três vezes com PBS.
Diluir o anticorpo secundário anti-rato de cabra IgG Alexa 568 ou anti-frango de cabra IgG Alexa 488 em um a 200 no tampão de bloqueio. Adicione 200 microliters de anticorpo secundário diluído a cada poço e incubar à temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, lave as células três vezes com PBS.
Use o microscópio de fluorescência para verificar a expressão proteica. Um dia antes da expansão do vírus, 2,6 milhões de células CEF em cada frasco T25. Descongele pelo menos três clones positivos e adicione um frasco de células ou vírus a cada frasco.
Incubar os frascos a 38,5 graus Celsius com dióxido de carbono de 5% até que seja observado um efeito citopático de 50%. Em seguida, colher as células em dois mililitros de meio de cultura. Infecte 50 microliters para um novo frasco T25 que foi pré-semeado com células CEF para a próxima geração.
Continue recombinando o vírus recombinante por pelo menos 15 gerações. Usando PCR, analise cada geração de vírus para a presença da sequência VP2. O uso de um ensaio de imunofluorescência indireta analisa cada geração de vírus da expressão VP2.
Após a triagem de células únicas, o vírus purificado obtido é analisado por três PCR de junção prime, que mostra um produto PCR do tamanho esperado. Após a excisão do repórter da GFP pela Cre recombina mais de 50% das placas perderam sua expressão GFP. A placa purificada após a excisão de GFP é obtida por classificação de célula única e é ainda confirmada por cinco PCR de junção prime que mostra produto do tamanho esperado.
A expressão proteica é então confirmada pelo ensaio indireto de imunofluorescência com anticorpo monoclonal específico VP2 e soro de frango anti-HVT. Como esperado, as células infectadas com o HVT parental só podem ser manchadas pelo soro anti-HVT. Enquanto células infectadas por HVT recombinantes mostram claramente a expressão do gene VP2.
Para gerar um vírus recombinante é necessária uma alta taxa de transfecção para maximizar a chance do vírus e a inserção para atender na mesma célula para a edição ocorrer. Após este procedimento, podem ser realizados experimentos em animais para avaliar a imunogenicidade e a eficácia das vacinas recombinantes. O desenvolvimento de novas vacinas vetoriais multivalentes usando a plataforma do sistema CRISPR/Cas9 descrita aqui será altamente benéfico para a indústria avícola para proteger contra múltiplas doenças avícolas.
