右心导管插入术后天鹅管囊小贴中内皮细胞的提取

该方法为解决肺血管研究领域的一些关键问题提供了一种新方法，如肺高血压内性增殖机制的分子路径。这种方法的主要优点是，它提供了肺血管内皮的一分钟的细胞活检，而不会给患者带来额外的风险。演示该手术的将是我们的临床协调员雷纳·佩雷斯小姐和我的实验室经理菲利普·加洛博士。

导管从护套中取走后，立即浸入含有 40 毫升冷却无菌盐水的 50 毫升离心管中。旋转导管几次以去除任何血液，如有必要，冲洗导管以去除管内保留的血液。切断导管尖端的五厘米，并允许它落入离心管。

使用钳子立即取出尖端，并将其转移到含有 15 毫升内皮细胞生长介质的 15 毫升离心管中。接下来，密封管。将管子放在冰上，然后转移到实验室。

要么立即处理样品，要么将样品包装在湿冰上，连夜运送到实验室进行加工。气球保持浸入介质中至关重要。因此，确保15 mL管中的头部空间最小，只需用内皮细胞生长介质完全填充。

首先，在清洁的15毫升离心管中加入5毫升的细胞分离溶液。把管子放在冰上。使用一毫升注射器，从床边收集管中剩下的一毫升内皮细胞介质中抽出一毫升。

小心地将一毫升注射器的针头插入导丝对面的白孔中。将导管尖端放入包含细胞分离溶液的 15 毫升离心管中。用大约200微升的介质充气气球，小心不要爆裂。

将管子放在冰上，让导管在细胞分离溶液中放置五分钟，气球充气。在此之后，将管内的内容倒入100毫米的盘中，确保气球被放置在这个细胞分离溶液的水坑中。使用细胞刮刀，刮膨胀的气球，聚焦在气球的两极，在那里它遇到导管。

接下来，确保电池刮刀至少接触气球的整个表面两次，并定期在细胞分离溶液中冲洗细胞刮刀。将气球放气，然后用刷牙运动刮擦。然后在细胞分离溶液的水坑中冲洗细胞刮刀。

将导管尖端、针头和细胞刮刀丢弃到适当的废物容器中。将含有细胞收获的细胞分离溶液倒入 50 毫升离心管中。摇动收集管，将剩余的介质倒入收集的样品中。

将样品以650倍G离心，4摄氏度离心10分钟。吸气介质，小心不要打扰或吸入颗粒。将颗粒重新悬浮在一粒冷冻红细胞解液中，将悬浮液转移到1.5微升离心管中，并在4摄氏度下轻轻摇动管体10分钟。

将管在500倍G下离心，4摄氏度离心5分钟。然后吸红血球解液。将颗粒重新在含有 PBS、FcR 阻滞剂和防人 CD-146 微珠的溶液中。

在4摄氏度下孵育15分钟。加入一毫升的冰镇PBS。在500倍的G和4摄氏度的离心机5分钟。

吸制上一液，将颗粒重新在一毫升的冷却PBS中。接下来，在室温下将磁性 LS 柱放在磁性机架上。通过添加一毫升 PBS 来为列提供底向，并允许整个卷流过。

丢弃流式。将样品加载到磁柱上，然后丢弃流经。每次洗涤时，使用三毫升的冷却 PBS 清洗柱三次。

丢弃所有这些流式。然后将三毫升冷却PBS加入15毫升离心管。从机架上拆下磁铁柱，然后将 PBS 从管中倒入柱中。

快速将柱放入离心管中，以捕获流经。立即与柱塞一起跳柱。样品现已被净化，并准备固定、染色或培养。

在这项研究中，细胞在右心导管化后从天鹅-甘兹导管尖端纯化。这些细胞绑定到CD-146选择列，并且具有与培养的原发性人类肺动脉内皮细胞无法区分的正向和侧面散射轮廓。由于导管气球只与引入器护套、肺动脉血管壁和血液进行物理接触，并且证明这些细胞不是从血液中衍生的，因此假定它们来自肺动脉血管壁。

按照程序采集的细胞可以通过多种方法进行分析，如流细胞学、qPCR、测序和蛋白混。对于传统的西方印迹来说，细胞产量太低，但可以考虑低输入的印迹方法。细胞可以培养，但这是非常困难的，而且并不总是在我们的手中成功。

如果要尝试培养，必须尽量减少从患者那里收集尖端与最终纯化和电镀步骤之间的间隔，并确保样品在方法的所有处理步骤中保持冷。不要忘了，这个协议涉及与人类血液和组织的工作。必须遵守普遍预防措施。

特别是，在协议的早期，有一个步骤，涉及插入一个锋利的针到导管尖端的切口端，这是被患者的血液污染。永远不要忘记，在这一步中，为了避免针棒的风险，导管尖端必须用血小板来保持，而不是用手指。