이 방법은 폐 고혈압의 암시 증식 메커니즘의 분자 경로와 같은 폐 혈관 연구 분야에서 주요 질문을 해결하는 새로운 접근법을 제공합니다. 이 방법의 주요 장점은 환자에게 추가 위험없이 폐 혈관 내피의 분 세포 생검을 제공한다는 것입니다. 절차를 시연하는 것은 우리의 임상 코디네이터 인 미스 레나 페레즈와 내 실험실의 매니저인 필립 갈로 박사가 될 것입니다.
카테터가 칼집에서 철수한 후, 차가운 멸균 식염수 40밀리리터를 함유한 50밀리리터 원심분리기 튜브에 즉시 담급니다. 카테터를 여러 번 소용돌이치면 혈액을 제거하고 필요한 경우 그 안에 존재하는 혈액을 제거하기 위해 라인을 플러시하십시오. 카테터 팁의 5센티미터를 잘라 내고 원심분리관에 빠질 수 있습니다.
집게를 사용하여 즉시 팁을 제거하고 내피 세포 성장 배지의 15 밀리리터를 포함하는 15 밀리리터 원심분리기 튜브로 이송합니다. 다음으로 튜브를 밀봉합니다. 튜브를 얼음 위에 놓고 실험실로 옮습니다.
즉시 샘플을 처리하거나 처리가 발생하는 실험실로 하룻밤 배송을 위해 젖은 얼음에 샘플을 포장. 풍선이 매체에 침지되는 것이 중요합니다. 따라서 내피 세포 성장 배지로 완전히 채우면 15mL 튜브에 최소한의 헤드 공간이 있는지 확인하십시오.
먼저 깨끗한 15 밀리리터 원심분리기 튜브에 5밀리리터의 세포 분리 용액을 추가합니다. 이 튜브를 얼음 위에 놓습니다. 1 밀리리터 주사기를 사용하여 침대 옆 수집 튜브에 남아있는 내피 세포 매체의 1 밀리리터를 그립니다.
조심스럽게 가이드 와이어의 반대흰색 구멍에 1 밀리리터 주사기의 바늘을 삽입합니다. 카테터 팁을 세포 분리 용액이 포함된 15 밀리리터 원심분리기 튜브에 넣습니다. 약 200 마이크로리터의 미디어로 풍선을 팽창시키지 않도록 주의하십시오.
튜브를 얼음 위에 놓고 카테터가 풍선을 팽창시키면 5분 동안 셀 분리 용액에 앉게 합니다. 그런 다음 튜브의 내용을 100mm 접시에 부어 풍선이 세포 분리 용액의 웅덩이에 배치되도록합니다. 셀 스크레이퍼를 사용하여 팽창된 풍선을 긁어 내고 카테터를 만나는 풍선의 기둥에 집중하십시오.
다음으로, 셀 스크레이퍼가 풍선의 전체 표면에 적어도 두 번 접촉하고 주기적으로 세포 분리 용액에서 세포 스크레이퍼를 헹구는지 확인합니다. 풍선을 수축하고 칫솔질 동작으로 긁어냅니다. 그런 다음 세포 분리 용액의 웅덩이에서 세포 스크레이퍼를 헹구는 것입니다.
카테터 팁, 바늘 및 셀 스크레이퍼를 적절한 폐기물 용기에 버리십시오. 세포 수확을 포함하는 세포 분리 용액을 50 밀리리터 원심분리기 튜브에 붓습니다. 수집 튜브를 흔들어 수집된 샘플에 남은 미디어를 붓습니다.
원심 분리는 650 배 G, 10 분 동안 섭씨 4도에서 샘플을 원심 분리합니다. 미디어를 흡인하고, 펠릿을 방해하거나 흡인시키지 않도록 주의하십시오. 차가운 적혈구 용액의 1 밀리터에서 펠릿을 다시 중단하고이 현탁액을 1.5 마이크로 리터 원심 분리 튜브로 옮기고 10 분 동안 4섭씨에서 튜브를 부드럽게 흔들어 줍니다.
원심 분리는 500 배 G에서 튜브, 5 분 동안 섭씨 4도. 그런 다음 적혈구 용해 용액을 흡인시합니다. PBS, FcR 차단제 및 항인간 CD-146 마이크로비드를 포함하는 용액에서 펠릿을 다시 중단합니다.
섭씨 4도에서 15분간 배양하세요. 차가운 PBS 1 밀리리터를 추가합니다. 원심분리기는 500배, 섭씨 4도에서 5분간.
상류체를 흡인하고 차가운 PBS의 1 밀리리터에서 펠릿을 재놓습니다. 다음으로, 실온에서 자기 랙에 마그네틱 LS 컬럼을 놓습니다. PBS의 밀리리터 1밀리리터를 추가하고 전체 볼륨이 흐르도록 하여 컬럼을 프라임합니다.
흐름을 삭제합니다. 마그네틱 컬럼에 샘플을 로드하고 흐름 스루를 버립니다. 매 세척에 대해 3 밀리리터의 차가운 PBS를 사용하여 컬럼을 세 번 씻으세요.
이 흐름을 모두 폐기합니다. 그런 다음 15 밀리리터 원심분리기 튜브에 차가운 PBS 3밀리리터를 추가합니다. 랙에서 자석 열을 제거하고 튜브에서 PBS를 열에 붓습니다.
컬럼을 원심분리기 튜브에 빠르게 배치하여 흐름을 잡습니다. 즉시 기둥과 함께 공급 된 플런저와 함께 급락. 샘플은 이제 정제되고 고정, 염색 또는 문화권에 대한 준비가 되었습니다.
이 연구에서, 세포는 오른쪽 심장 카테터화 후 스완 간즈 카테터 팁에서 정제된다. 이러한 세포는 CD-146 선택 기둥에 결합하고 배양된 1차 인간 폐 동맥 내피 세포와 구별할 수 없는 전방 및 측면 산란 프로파일을 갖는다. 카테터 풍선은 피의 칼집, 폐동맥 혈관 벽 및 혈액과 물리적 접촉에만 있기 때문에 세포는 혈액에서 파생되지 않는 것으로 입증되므로 폐 동맥 혈관 벽에서 유래한 것으로 가정됩니다.
시술에 따라 수확된 세포는 유동 세포측정, qPCR, 시퀀싱 및 프로테오믹스와 같은 다양한 방법에 의해 분석될 수 있다. 세포 수율은 기존의 서양 얼룩에 비해 너무 낮지만, 낮은 입력 블로팅 방법론을 고려할 수 있습니다. 세포를 배양 할 수 있지만 이것은 매우 어렵고 항상 우리의 손에 성공하지는 못합니다.
배양을 시도하려면, 환자로부터 의 카트 팁의 수집 사이의 간격과 최종 정화 및 도금 단계 사이의 간격을 최소화하고, 샘플이 방법의 모든 처리 단계에 걸쳐 차가운 유지되도록하는 것이 중요합니다. 이 프로토콜은 인간의 혈액과 조직과 함께 작업 포함 잊지 마세요. 보편적 인 예방 조치를 준수해야합니다.
특히, 환자의 혈액으로 오염되는 카테터 팁의 절단 끝에 날카로운 바늘을 삽입하는 프로토콜초기에 단계가 있습니다. 바늘 스틱의 위험을 피하기 위해 카테터 팁이 손가락이 아닌이 단계에서 hemostats로 개최해야한다는 것을 잊지 마십시오.
