Cette méthode fournit une nouvelle approche pour répondre aux questions clés dans le domaine de la recherche vasculaire pulmonaire, telles que la voie moléculaire des mécanismes de prolifération intimale dans l’hypertension pulmonaire. Le principal avantage de cette méthode est qu’elle fournit une biopsie cellulaire minute de l’endothélium vasculaire pulmonaire sans risque supplémentaire pour le patient. Mlle Reina Perez, notre coordinatrice clinique, et le Dr Phillip Gallo, directeur de mon laboratoire, démontreront la procédure.
Après le retrait du cathéter de la gaine, plongez-le immédiatement dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres contenant 40 millilitres de solution saline stérile réfrigérée. Faites tourbillonner le cathéter plusieurs fois pour enlever le sang et rincer la ligne si nécessaire pour enlever le sang conservé à l’intérieur. Coupez les cinq centimètres distal de la pointe du cathéter et laissez-le tomber dans le tube de centrifugeuse.
Utilisez des forceps pour enlever immédiatement la pointe et la transférer dans un tube centrifugeuse de 15 millilitres contenant 15 millilitres de milieu de croissance cellulaire endothéliale. Ensuite, scellez le tube. Placez le tube sur la glace et transférez-le au laboratoire.
Traiter immédiatement l’échantillon ou emballer l’échantillon sur de la glace mouillée pour l’expédition de nuit au laboratoire où le traitement aura lieu. Il est essentiel que le ballon reste immergé dans le milieu. Assurez-vous donc qu’il y a un espace minimal dans le tube de 15 mL en le remplissant complètement avec un milieu de croissance cellulaire endothéliale.
Tout d’abord, ajouter cinq millilitres de solution de détachement cellulaire à un tube de centrifugeuse propre de 15 millilitres. Placez ce tube sur la glace. À l’aide d’une seringue d’un millilitre, dessinez un millilitre de médias cellulaires endothéliales à partir de ce qui reste dans le tube de collecte de chevet.
Insérez soigneusement l’aiguille de la seringue d’un millilitre dans le trou blanc opposé au fil de guidage. Placez la pointe du cathéter dans le tube de centrifugeuse de 15 millilitres qui contient la solution de détachement cellulaire. Gonflez le ballon avec environ 200 microlitres de supports, en prenant soin de ne pas l’éclater.
Placez le tube sur la glace et laissez le cathéter reposer dans la solution de détachement cellulaire pendant cinq minutes, le ballon gonflé. Après cela, versez le contenu du tube dans un plat de 100 millimètres, en s’assurant que le ballon est placé dans cette flaque de solution de détachement cellulaire. À l’aide d’un grattoir cellulaire, gratter le ballon gonflé, se concentrer sur les poteaux du ballon où il rencontre le cathéter.
Ensuite, assurez-vous que le grattoir de cellules entre en contact avec toute la surface du ballon au moins deux fois, et rincez périodiquement le grattoir cellulaire dans la solution de détachement cellulaire. Dégonflez le ballon et grattez-le avec un mouvement de brossage. Rincez ensuite le grattoir cellulaire dans la flaque d’eau de la solution de détachement cellulaire.
Jetez la pointe du cathéter, l’aiguille et le grattoir dans un contenant de déchets approprié. Verser la solution de détachement cellulaire qui contient la récolte cellulaire dans un tube de centrifugeuse de 50 millilitres. Secouez le tube de collecte et versez le reste des supports de l’échantillon dans l’échantillon recueilli.
Centrifuger l’échantillon à 650 fois G, et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Aspirez les médias, en prenant soin de ne pas déranger ou aspirer la pastille. Resuspendez la pastille dans un millimètre de solution de lyse refroidie de globule rouge, et transférez cette suspension à un tube de centrifugeuse de 1,5 microlitre, et secouez doucement le tube à quatre degrés celsius pendant 10 minutes.
Centrifuger le tube à 500 fois G, et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Puis aspirer la solution de lyse des globules rouges. Resuspendez la pastille dans une solution contenant des microbilles PBS, FcR blocker et anti-humaine CD-146.
Incuber à quatre degrés Celsius pendant 15 minutes. Ajouter un millilitre de PBS réfrigéré. Centrifugeuse à 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes.
Aspirez le supernatant et resuspendez la pastille en un millilitre de PBS réfrigéré. Ensuite, placez une colonne magnétique LS sur un support magnétique à température ambiante. Primez la colonne en ajoutant un millilitre de PBS, et en permettant à l’ensemble du volume de circuler à travers.
Jetez le flux à travers. Chargez l’échantillon sur la colonne magnétique et jetez le flux. Lavez la colonne trois fois à l’aide de trois millilitres de PBS réfrigéré pour chaque lavage.
Jetez tout ce flux à travers. Ajouter ensuite trois millilitres de PBS réfrigéré à un tube de centrifugeuse de 15 millilitres. Retirez la colonne magnétique de la grille et versez le PBS du tube dans la colonne.
Placez rapidement la colonne dans le tube de centrifugeuse pour attraper le flux à travers. Plongez immédiatement avec le piston fourni avec la colonne. L’échantillon est maintenant purifié, et prêt pour la fixation, la coloration ou la culture.
Dans cette étude, les cellules sont purifiées à partir des bouts de cathéter Swan-Ganz après cathétérisme cardiaque droit. Ces cellules se lient à une colonne de sélection CD-146, et ont des profils de dispersion avant et latérale qui sont indiscernables des cellules endothéliales primaires d’artère pulmonaire primaire de culture. Comme le ballon cathéter n’est en contact physique qu’avec la gaine de l’introduction, la paroi du vaisseau de l’artère pulmonaire et le sang, et que les cellules ne proviennent pas du sang, on suppose donc qu’elles proviennent de la paroi du vaisseau de l’artère pulmonaire.
Après la procédure, les cellules récoltées peuvent être analysées par une variété de méthodes, telles que la cytométrie du débit, qPCR, séquençage et protéomique. Les rendements cellulaires sont trop faibles pour les taches occidentales conventionnelles, mais de faibles méthodes de ballonnement des entrées pourraient être envisagées. Les cellules peuvent être cultivés, mais c’est très difficile, et il ne réussit pas toujours dans nos mains.
Si la culture doit être tentée, il est important de minimiser l’intervalle entre la collecte de la pointe de cathétérisme du patient, et les étapes finales de purification et de placage, et de s’assurer que l’échantillon est maintenu au froid tout au long de toutes les étapes de manipulation de la méthode. N’oubliez pas que ce protocole implique de travailler avec le sang et les tissus humains. Des précautions universelles doivent être observées.
En particulier, il y a une étape tôt dans le protocole qui implique l’insertion d’une aiguille pointue dans l’extrémité coupée de la pointe de cathéter qui est contaminée par le sang du patient. N’oubliez jamais que la pointe du cathéter doit être tenue avec des hémostats pendant cette étape, et non avec vos doigts, afin d’éviter le risque d’une piqûre d’aiguille.
