Este método fornece uma nova abordagem para abordar questões-chave no campo da pesquisa vascular pulmonar, como o caminho molecular dos mecanismos de proliferação intimal na hipertensão pulmonar. A principal vantagem deste método é que ele fornece uma biópsia celular minuciosa do endotélio vascular pulmonar sem risco adicional para o paciente. Demonstrando o procedimento estarão a Srta. Reina Perez, nossa Coordenadora Clínica, e o Dr. Phillip Gallo, gerente do meu laboratório.
Depois que o cateter for retirado da bainha, mergulhe-o imediatamente em um tubo de centrífuga de 50 mililitros contendo 40 mililitros de soro fisiológico estéril refrigerado. Gire o cateter várias vezes para remover qualquer sangue, e lave a linha se necessário para remover o sangue retido dentro dele. Corte os cinco centímetros distais da ponta do cateter e deixe cair no tubo de centrífuga.
Use fórceps para remover imediatamente a ponta e transfira-a para um tubo de centrífuga de 15 mililitros contendo 15 mililitros de meio de crescimento celular endotelial. Em seguida, selar o tubo. Coloque o tubo no gelo, e transfira para o laboratório.
Processe a amostra imediatamente ou embale a amostra em gelo molhado para envio noturno para o laboratório onde ocorrerá o processamento. É fundamental que o balão permaneça imerso no meio. Portanto, certifique-se de que há espaço mínimo na cabeça no tubo de 15 mL, preenchendo-o completamente com meio de crescimento celular endotelial.
Primeiro, adicione cinco mililitros de solução de descolamento celular a um tubo de centrífuga de 15 mililitros limpo. Coloque este tubo no gelo. Usando uma seringa de um mililitro, desenhe um mililitro de mídia celular endotelial do que permanece no tubo de coleta de cabeceira.
Insira cuidadosamente a agulha da seringa de um mililitro no orifício branco em frente ao fio-guia. Coloque a ponta do cateter no tubo de centrífuga de 15 mililitros que contém a solução de descolamento celular. Infle o balão com aproximadamente 200 microliters de mídia, tomando cuidado para não estourá-lo.
Coloque o tubo no gelo e deixe o cateter sentar na solução de descolamento celular por cinco minutos com o balão inflado. Depois disso, despeje o conteúdo do tubo em um prato de 100 milímetros, certificando-se de que o balão seja colocado nesta poça de solução de desprendimento celular. Usando um raspador de célula, raspe o balão inflado, concentre-se nos polos do balão onde ele encontra o cateter.
Em seguida, certifique-se de que o raspador de células contate toda a superfície do balão pelo menos duas vezes, e enxágue periodicamente o raspador de células na solução de desapego celular. Esvazie o balão e raspe-o com um movimento de escovação. Em seguida, enxágue o raspador de células na poça da solução de descolamento celular.
Descarte a ponta do cateter, a agulha e o raspador de células em um recipiente de resíduos apropriado. Despeje a solução de descolamento celular que contém a colheita celular em um tubo de centrífuga de 50 mililitros. Agite o tubo de coleta e despeje a mídia restante dele na amostra coletada também.
Centrifugar a amostra a 650 vezes G, e quatro graus Celsius por 10 minutos. Aspirar a mídia, tomando cuidado para não perturbar ou aspirar a pelota. Resuspenque a pelota em um mililitro de solução de lise de glóbulos vermelhos resfriados, e transfira esta suspensão para um tubo de centrífuga de 1,5 microliter, e balance suavemente o tubo a quatro graus celsius por 10 minutos.
Centrifugar o tubo a 500 vezes G, e quatro graus celsius por cinco minutos. Em seguida, aspire a solução de lise de glóbulos vermelhos. Resuspenha a pelota em uma solução contendo pbs, bloqueador de FCR e microesferas de CD-146 anti-humanos.
Incubar a 4 graus celsius por 15 minutos. Adicione um mililitro de PBS refrigerado. Centrifugar a 500 vezes G e 4 graus celsius por cinco minutos.
Aspire o supernatante e resuspenda a pelota em um mililitro de PBS refrigerado. Em seguida, coloque uma coluna de LS magnética em um rack magnético à temperatura ambiente. Prime a coluna adicionando um mililitro de PBS, e permitindo que todo o volume flua.
Descarte o fluxo. Carregue a amostra na coluna magnética e descarte o fluxo. Lave a coluna três vezes usando três mililitros de PBS refrigerados para cada lavagem.
Descarte todo esse fluxo. Em seguida, adicione três mililitros de PBS refrigerado a um tubo de centrífuga de 15 mililitros. Remova a coluna do ímã do rack e despeje o PBS do tubo na coluna.
Coloque rapidamente a coluna no tubo de centrífuga para capturar o fluxo. Mergulhe imediatamente com o êmbolo fornecido com a coluna. A amostra está agora purificada, e pronta para fixação, coloração ou cultura.
Neste estudo, as células são purificadas a partir de pontas de cateter swan-Ganz após cateterismo cardíaco direito. Essas células se ligam a uma coluna de seleção CD-146, e têm perfis de dispersão para frente e lateral que são indistinguíveis das células endoteliais primárias da artéria pulmonar humana. Como o balão do cateter está apenas em contato físico com a baia introdutor, a parede do vaso da artéria pulmonar e o sangue, e as células são demonstradas para não derivar do sangue, presume-se, portanto, que eles derivaram da parede do vaso da artéria pulmonar.
Após o procedimento, as células colhidas podem ser analisadas por uma variedade de métodos, como citometria de fluxo, qPCR, sequenciamento e proteomix. Os rendimentos das células são muito baixos para a mancha ocidental convencional, mas metodologias de manchas de entrada baixas podem ser consideradas. As células podem ser cultivadas, mas isso é muito difícil, e nem sempre tem sucesso em nossas mãos.
Se a cultura for tentada, é importante minimizar o intervalo entre a coleta da ponta do cath do paciente e as etapas finais de purificação e revestimento, e garantir que a amostra seja mantida fria em todas as etapas de manuseio do método. Não se esqueça que este protocolo envolve trabalhar com sangue e tecido humano. Precauções universais devem ser observadas.
Em particular, há um passo no início do protocolo que envolve inserir uma agulha afiada na extremidade cortada da ponta do cateter que está contaminada com o sangue do paciente. Nunca se esqueça que a ponta do cateter deve ser mantida com hemostats durante esta etapa, não com os dedos, a fim de evitar o risco de uma agulha.
