توفر هذه الطريقة طريقة جديدة لمعالجة الأسئلة الرئيسية في مجال البحوث الوعائية الرئوية، مثل المسار الجزيئي لآليات الانتشار الايثاري في ارتفاع ضغط الدم الرئوي. الميزة الرئيسية لهذه الطريقة هي أنه يوفر خزعة خلوية دقيقة من إندورفيوم الأوعية الدموية الرئوية دون مخاطر إضافية للمريض. إثبات الإجراء سيكون الآنسة (رينا بيريز) منسقينا السريريين و الدكتور (فيليب جالو) مدير مختبري
بعد سحب القسطرة من غماد، تزج على الفور في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر تحتوي على 40 ملليلتر من المالحة العقيمة المبردة. دوامة القسطرة عدة مرات لإزالة أي دم، ومسح الخط إذا لزم الأمر لإزالة الدم الاحتفاظ بها داخله. قطع 5 سنتيمترات من طرف القسطرة، والسماح لها أن تقع في أنبوب الطرد المركزي.
استخدم ملقط لإزالة الطرف على الفور، ونقله إلى أنبوب طرد مركزي 15 ملليلتر يحتوي على 15 ملليلتر من وسيط نمو الخلايا البطانية. بعد ذلك، أغلق الأنبوب. ضع الأنبوب على الجليد، ونقله إلى المختبر.
إما معالجة العينة فورا أو حزمة العينة على الجليد الرطب للشحن بين عشية وضحاها إلى المختبر حيث ستتم المعالجة. من المهم أن يبقى البالون مغمورًا في الوسط. لذا تأكد من وجود مساحة رأس الحد الأدنى في أنبوب 15 مل عن طريق ملئه تماما مع وسط نمو الخلايا البطانية.
أولاً، أضف خمسة ملليلترات من محلول مفرزة الخلايا إلى أنبوب طرد مركزي نظيف 15 ملليلتر. ضع هذا الأنبوب على الجليد باستخدام حقنة ملليلتر واحد، رسم ملليلتر واحد من وسائل الإعلام خلية endothelial من ما تبقى في أنبوب جمع السرير.
أدخل بعناية إبرة حقنة المليلتر الواحدة في الثقب الأبيض المقابل للسلك الإرشادي. ضع طرف القسطرة في أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر الذي يحتوي على حل انفصال الخلية. تضخيم البالون مع ما يقرب من 200 ميكرولترات من وسائل الإعلام، مع الحرص على عدم انفجاره.
ضع الأنبوب على الجليد، ودع القسطرة تجلس في محلول مفرزة الخلايا لمدة خمس دقائق مع تضخم البالون. بعد ذلك، صب محتويات الأنبوب في طبق 100 ملليمتر، والتأكد من أن البالون يوضع في هذه بركة من حل مفرزة الخلية. باستخدام مكشطة الخلية ، كشط البالون المتضخم ، والتركيز على أعمدة البالون حيث يلتقي القسطرة.
بعد ذلك، تأكد من اتصال مكشطة الخلية بالسطح بأكمله للبالون مرتين على الأقل، وشطف مكشطة الخلية بشكل دوري في حل مفرزة الخلايا. فرغ البالون وكشطه بحركة بالفرشاة. ثم شطف مكشطة الخلية في بركة من حل مفرزة الخلية.
تخلص من طرف القسطرة والإبرة وكشطة الخلايا في حاوية نفايات مناسبة. صب حل مفرزة الخلية التي تحتوي على حصاد الخلية في أنبوب جهاز طرد مركزي 50 ملليلتر. يهز أنبوب جمع، وصب وسائل الإعلام المتبقية منه في العينة التي تم جمعها كذلك.
الطرد المركزي العينة في 650 مرة G، وأربع درجات مئوية لمدة 10 دقيقة. التعرق وسائل الإعلام، مع الحرص على عدم إزعاج أو التعرق بيليه. Resuspend بيليه في ملليمتر واحد من محلول خلايا الدم الحمراء المبردة، ونقل هذا التعليق إلى أنبوب الطرد المركزي 1.5 ميكرولتر، وروك بلطف الأنبوب في أربع درجات مئوية لمدة 10 دقائق.
جهاز طرد مركزي الأنبوب في 500 مرة G، وأربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق. ثم التعرق حل خلايا الدم الحمراء. Resuspend بيليه في حل يحتوي على برنامج تلفزيوني ، مانع FcR ، ومضاد للراديلات CD-146.
احتضان في أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة. إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني مبردة. جهاز طرد مركزي بمعدل 500 ضعف G و أربع درجات مئوية لمدة خمس دقائق.
التعرق وssuspend بيليه في ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني مبردة. بعد ذلك، ضع عمود LS مغناطيسيًا على رف مغناطيسي في درجة حرارة الغرفة. رئيس العمود عن طريق إضافة ملليلتر واحد من برنامج تلفزيوني، والسماح لوحدة التخزين بأكملها من خلال التدفق.
تجاهل التدفق من خلال. قم بتحميل العينة على العمود المغناطيسي، وتجاهل التدفق. غسل العمود ثلاث مرات باستخدام ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني مبردة لكل غسل.
تجاهل كل هذا التدفق من خلال. ثم إضافة ثلاثة ملليلتر من برنامج تلفزيوني مبردة إلى أنبوب الطرد المركزي 15 ملليلتر. إزالة العمود المغناطيس من الرف، وصب برنامج تلفزيوني من الأنبوب في العمود.
ضع العمود بسرعة في أنبوب الطرد المركزي لالتقاط التدفق من خلال. يغرق على الفور مع المكبس الموردة مع العمود. يتم الآن تنقية العينة، وعلى استعداد لتثبيت، تلطيخ، أو الثقافة.
في هذه الدراسة، يتم تنقية الخلايا من نصائح قسطرة سوان غانز بعد قسطرة القلب الأيمن. ترتبط هذه الخلايا بعمود تحديد CD-146، ولها ملفات تعريف مبعثرة جانبية ولأمام لا يمكن تمييزها عن الخلايا البطانية الرئوية الأساسية للرؤوسي البشري المستزرعة. بما أن بالون القسطرة لا يكون إلا على اتصال جسدي مع صمد المقدم وجدار الشريان الرئوي والدم ، والخلايا التي ثبت أنها لا تستمد من الدم ، فمن المفترض بالتالي أنها مستمدة من جدار الشريان الرئوي.
بعد الإجراء يمكن تحليل الخلايا المقطوعة من خلال مجموعة متنوعة من الأساليب، مثل تدفق الخلايا، qPCR، التسلسل، والبروتيوميكس. إن غلة الخلايا منخفضة جداً بالنسبة لللطخة الغربية التقليدية، ولكن يمكن النظر في منهجيات النشاف منخفضة المدخلات. يمكن أن تكون الخلايا مثقفة ، ولكن هذا صعب للغاية ، ولا ينجح دائمًا في أيدينا.
إذا كان لثقافة أن يكون حاول، من المهم تقليل الفاصل الزمني بين جمع طرف كاث من المريض، والخطوات النهائية لتنقية والطلاء، وضمان أن يتم الاحتفاظ عينة الباردة في جميع جميع الخطوات معالجة الأسلوب. لا تنسى أن هذا البروتوكول ينطوي على العمل مع الدم البشري والأنسجة. يجب مراعاة الاحتياطات الشاملة.
على وجه الخصوص، هناك خطوة في وقت مبكر من البروتوكول الذي ينطوي على إدخال إبرة حادة في نهاية قطع طرف القسطرة التي هي ملوثة بدم المريض. لا تنس أبدا أن طرف القسطرة يجب أن تعقد مع الهيموستاتات خلال هذه الخطوة، وليس مع أصابعك، من أجل تجنب خطر عصا إبرة.
