Этот метод обеспечивает новый подход к решению ключевых вопросов в области легочных сосудистых исследований, таких как молекулярный путь механизмов интимального пролиферации при легочной гипертензии. Основным преимуществом этого метода является то, что он обеспечивает минутную клеточную биопсию легочного сосудистого эндотелия без дополнительного риска для пациента. Демонстрация процедуры будет мисс Рейна Перес, наш клинический координатор, и д-р Филипп Галло, менеджер моей лаборатории.
После того, как катетер снимается с оболочки, немедленно погрузите его в 50-миллилитровую центрифугу, содержащую 40 миллилитров охлажденного стерильного солевого раствора. Закружить катетер несколько раз, чтобы удалить кровь, и промыть линию, если это необходимо, чтобы удалить кровь сохраняется в нем. Отрежьте дистальные пять сантиметров кончика катетера и дайте ему упасть в центрифугу.
Используйте типсы, чтобы немедленно удалить кончик, и передать его в 15 миллилитровую центрифугу трубку, содержащую 15 миллилитров эндотелиальной среды роста клеток. Затем запечатай трубку. Поместите трубку на лед и перенесите в лабораторию.
Либо обработать образец немедленно или упаковать образец на мокром льду для ночной доставки в лабораторию, где обработка будет происходить. Очень важно, чтобы воздушный шар оставался погруженным в среду. Поэтому убедитесь, что есть минимальное пространство головы в 15 мл трубки, заполнив его полностью с эндотелиальной клеточной среды роста.
Во-первых, добавьте пять миллилитров раствора клеточного отслоения в чистую 15-миллилитровую центрифугу. Поместите эту трубку на лед. Используя один миллилитровый шприц, нарисуйте один миллилитр эндотелиальных клеточных средств массовой информации из того, что осталось в трубке для сбора прикроватных кроватей.
Аккуратно вставьте иглу одного миллилитрового шприца в белое отверстие напротив направляющий проволоки. Поместите наконечник катетера в 15-миллилитровую центрифугу, которая содержит раствор клеточного отслоения. Надуть воздушный шар примерно 200 микролитров мультимедиа, будьте осторожны, чтобы не лопнуть его.
Поместите трубку на лед, и пусть катетер сидеть в клеточном растворе отряда в течение пяти минут с воздушным шаром надуты. После этого, залить содержимое трубки в 100 миллиметров блюдо, убедившись, что воздушный шар находится в этой луже клеточного раствора отряда. Используя сотовый скребок, соскребать надутый воздушный шар, сосредоточиться на полюсах воздушного шара, где он отвечает катетер.
Затем убедитесь, что сотовый скребок контактирует со всей поверхностью шарика по крайней мере дважды, и периодически прополощите сотовый скребок в растворе клеточного отряда. Сдуть воздушный шар и соскребать его с чисткой движения. Затем промыть клеточный скребок в луже раствора клеточного отслоения.
Отбросьте кончик катетера, иглу и клеточный скребок в соответствующий контейнер для отходов. Налейте раствор клеточного отслоения, содержащий урожай клеток, в 50-миллилитровую центрифугу. Встряхните трубку сбора, и залить оставшиеся средства массовой информации из него в собранный образец, а также.
Центрифуга образца в 650 раз G, и четыре градуса по Цельсию в течение 10 минут. Аспирировать средства массовой информации, будьте осторожны, чтобы не беспокоить или аспирировать гранулы. Resuspend гранулы в один миллиитер охлажденной красной крови лиза решение, и передать эту подвеску в 1,5 микролитр центрифуги трубки, и осторожно рок трубки при четырех градусах по Цельсию в течение 10 минут.
Центрифуга трубки при 500 раз G, и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут. Затем аспирировать раствор лиза красных кровяных телец. Повторное распределение гранул в растворе, содержащем блокатор PBS, FcR и анти-человеческие микробусы CD-146.
Инкубировать при четырех градусах по Цельсию в течение 15 минут. Добавьте один миллилитр охлажденного PBS. Центрифуга при 500 раз G и четыре градуса по Цельсию в течение пяти минут.
Аспирировать супернатант и повторно помыть гранулы в один миллилитр охлажденной PBS. Затем поместите магнитный столбец LS на магнитную стойку при комнатной температуре. Премьер столбца, добавив один миллилитр PBS, и позволяет весь объем течь через.
Отбросьте поток через. Загрузите образец на магнитную колонку и отбросьте протеку. Вымойте колонку три раза с помощью трех миллилитров охлажденного PBS для каждой стирки.
Откажитесь от всего этого потока через. Затем добавьте три миллилитров охлажденной PBS в 15 миллилитровую центрифугу трубки. Снимите столбец магнита со стойки и вылейте PBS из трубки в колонку.
Быстро поместите столбец в трубку центрифуги, чтобы поймать протекаемый. Немедленно окунитесь с поршенем, снабженным колонной. Образец теперь очищен, и готов к фиксации, окрашиванию или культуре.
В этом исследовании клетки очищаются от кончиков катетера Swan-Ganz после катетеризации сердца. Эти клетки связываются с колонкой выбора CD-146 и имеют профили перемотки вперед и сбоку, которые неотличимы от культурных первичных эндотелиальных клеток легочной артерии человека. Поскольку катетерный шар находится только в физическом контакте с оболочкой введения, стенка сосуда легочной артерии и кровь, и клетки, как по-продемонстрировано, не вытекают из крови, поэтому предполагается, что они получены из стенки сосуда легочной артерии.
После процедуры собранные клетки могут быть проанализированы различными методами, такими как цитометрия потока, qPCR, секвенирование и протеомикс. Урожайность клеток слишком низка для обычных западных пятно, но низкий вход blotting методологии могут быть рассмотрены. Клетки могут быть культурны, но это очень трудно, и это не всегда удается в наших руках.
Если культура должна быть предпринята, важно свести к минимуму интервал между сбором кончика кат от пациента, и окончательные шаги очистки и покрытия, и обеспечить, чтобы образец хранится холодной на протяжении всех этапов обработки метода. Не забывайте, что этот протокол включает в себя работу с человеческой кровью и тканями. Необходимо соблюдать всеобщие меры предосторожности.
В частности, есть шаг в начале протокола, который включает вставки острой иглы в конце разреза кончика катетера, который загрязнен кровью пациента. Никогда не забывайте, что кончик катетера должен быть проведен с гемостатами во время этого шага, а не пальцами, чтобы избежать риска иглы палкой.
