この方法は、肺高血圧症におけるインティマス増殖のメカニズムの分子経路など、肺血管研究の分野における重要な問題に対処するための新しいアプローチを提供する。この方法の主な利点は、患者に追加のリスクなしに肺血管内皮の分の細胞生検を提供することである。この手順のデモンストレーションは、臨床コーディネーターのレイナ・ペレスさんと、私の研究室のマネージャーであるフィリップ・ガロ博士です。
カテーテルが鞘から引き出された後、すぐに40ミリリットルの冷たい滅菌生理食塩水を含む50ミリリットル遠心管に浸す。カテーテルを数回旋回して血液を除去し、必要に応じてラインを洗い流して、その中に保持されている血液を除去する。カテーテル先端の遠位5センチを切り落とし、遠心分離管に落ちるようにします。
鉗子を使用してすぐに先端を取り除き、15ミリリットルの内皮細胞増殖培地を含む15ミリリットル遠心分離管に移します。次に、チューブを密封します。チューブを氷の上に置き、ラボに移します。
サンプルをすぐに処理するか、または加工が行われる実験室に一晩出荷するために、湿った氷の上にサンプルを詰めます。バルーンが培地に浸されたままにすることが重要です。だから、内皮細胞増殖培地で完全に充填することにより、15 mLチューブに最小限のヘッドスペースがあることを確認してください。
まず、5ミリリットルの細胞剥離液をクリーンな15ミリリットル遠心分離チューブに加えます。このチューブを氷の上に置きます。1ミリリットルの注射器を使用して、ベッドサイドコレクションチューブに残っているものから1ミリリットルの内皮細胞培地を引き出す。
1ミリリットルの注射器の針をガイドワイヤーの反対側の白い穴に慎重に挿入します。カテーテル先端を細胞剥離液を含む15ミリリットルの遠心分離管に入れる。約200マイクロリットルの媒体でバルーンを膨らませ、破裂しないように注意してください。
チューブを氷の上に置き、カテーテルをバルーンを膨らませて5分間細胞剥離液に座らせます。この後、チューブの内容物を100ミリメートル皿に注ぎ、バルーンが細胞剥離液のこの水たまりに置かれることを確認します。セルスクレーパーを使用して、膨張したバルーンを削り取り、カテーテルと出会うバルーンのポールに焦点を当てます。
次に、セルスクレーパーがバルーンの表面全体に少なくとも2回接触していることを確認し、細胞剥離液中のセルスクレーパーを定期的にリンスします。バルーンを収縮させ、ブラッシングモーションで削ります。次に、細胞剥離液の水たまりで細胞スクレーパーをすすぎます。
カテーテル先端、針、および細胞スクレーパーを適切な廃棄物容器に捨てます。50ミリリットルの遠心分離管に細胞収穫を含む細胞剥離液を注ぎます。回収管を振り、残りの培地を回収したサンプルにも注ぎます。
サンプルを650倍Gで遠心し、摂氏4度で10分間遠心する。メディアを吸引し、ペレットを邪魔したり吸引したりしないように注意する。冷やした赤血球溶解液の1ミリエーターでペレットを再懸濁し、この懸濁液を1.5マイクロリットル遠心管に移し、チューブを摂氏4度で10分間静かに揺らします。
チューブをGの500倍、摂氏4度で5分間遠心する。次に赤血球溶解液を吸引する。PBS、FcR遮断薬、抗ヒトCD-146マイクロビーズを含む溶液中のペレットを再懸濁する。
摂氏4度で15分間インキュベートします。冷やしたPBSを1ミリリットル加えます。500倍Gで遠心分離機、5分間摂氏4度。
上清を吸引し、1ミリリットルの冷蔵PBSでペレットを再懸濁する。次に、磁気 LS 列を室温の磁気ラックに置きます。PBSを1ミリリットル加えてカラムを盛り付け、ボリューム全体を流れ込まします。
フロースルーを破棄します。マグネットカラムにサンプルをロードし、フロースルーを破棄します。各洗浄に対して3ミリリットルの冷やされたPBSを使用して、カラムを3回洗います。
このフロースルーをすべて破棄します。その後、冷やしたPBSを3ミリリットルの遠心チューブに加えます。磁石カラムをラックから取り出し、チューブからカラムにPBSを注ぎます。
素早く柱を遠心管に入れ、流れを捕まえます。すぐに列に付属のプランジャーで急落します。サンプルは現在精製され、固定、染色、または培養の準備が整いました。
この研究では、細胞は右心カテーテル法の後にスワンガンツカテーテルの先端から精製される。これらの細胞はCD-146選択カラムに結合し、培養されたヒト肺動脈内皮細胞と区別がつかない前方および側面散乱プロファイルを有する。カテーテルバルーンは、導入者鞘と物理的に接触しているだけであるため、肺動脈血管壁と血液、および細胞が血液から誘導されないことが実証され、したがってそれらが肺動脈血管壁に由来すると仮定される。
採取した細胞の手順に従って、フローサイトメトリー、qPCR、シーケンシング、プロテオーミックスなどの様々な方法で分析することができます。セルの収率は従来のウェスタンブロットでは低すぎるが、低入力ブロッティング方法論が考慮される可能性がある。細胞は培養できますが、これは非常に困難であり、必ずしも私たちの手の中で成功するとは限りません。
培養を試みる場合は、患者からのキャス先端の採取と最終的な精製とめっきのステップの間隔を最小限に抑え、サンプルが方法のすべての処理ステップ全体を通して冷たく保たれていることを保証することが重要です。このプロトコルは、人間の血液と組織で作業することを忘れないでください。普遍的な予防措置を守らなければならない。
特に、患者の血液で汚染されたカテーテル先端の切り端に鋭い針を挿入することを含むプロトコルの早い段階があります。針の棒の危険を避けるために、カテーテル先端は指ではなく、このステップの間に止止めで保持されなければならないことを決して忘れないでください。
