原发性鸡初囊-细胞培养模型研究传染性囊内病病毒发病机制

这种方法可以帮助回答鸟类病毒学领域的关键问题，例如免疫抑制病毒如何与B细胞相互作用。这种技术的主要优点是细胞比实验室中目前使用的不朽细胞系更相关。虽然这种方法提供了对鸡细胞如何响应IBDV的见解，但它也可以应用于 ALV 和 REV。

这种方法减少了我们研究中的鸟类数量，并且对三个Rs是有益的，它代表动物在研究中的替换、减少和改进。在微生物安全柜中，将 BF 洗涤 30 毫升的冷 PBS 至少三次。将洗涤的组织转移到培养皿中，并加入 5 毫升 1X 胶原酶 D 溶液。

使用无菌剪刀或手术刀刀片将 BF 切割成直径小于 5 毫米的碎片。在37摄氏度下孵育，定期温和搅拌30分钟。在此之后，使用无菌的巴斯德移液器反复吸气混合物，以鼓励组织分解。

再在组织中加入5毫升1X胶原酶D溶液，并在37摄氏度下孵育，定期温和搅拌30分钟。重复这个过程，吸气混合物，加入新鲜的胶原酶D溶液，并孵育，直到组织完全消化。请注意，会有小颗粒不会进一步溶解。

通过100微米细胞过滤器将消化的细胞悬浮液传递到20毫升1X HBBS中，不带钙。在400次g下离心5分钟。丢弃上一提液，用 5%FBS 将颗粒重新在 10 毫升 1X RPMI 中。

然后，将10毫升的细胞悬浮液覆盖在含有聚糖和三聚氰酸钠的5毫升密度梯度介质上。确保两个图层之间有一个清晰的接口。在900倍g和4摄氏度的离心机20分钟。

细胞应在细胞介质和密度梯度介质之间的接口上形成一个带。接下来，使用无菌巴氏移液器去除细胞并将其转移到含有冷 PBS 的管中。将细胞在400次g中离心5分钟，然后在冷PBS中重新产生，以进行离心。

重复此洗涤三次。首先，将电池悬浮液以400倍g离心5分钟。将细胞在 30 毫升 1X 完整 IMDM 中重新发送。

拿一个等分的细胞悬浮液，并添加到 Trypan 蓝色溶液。计算排除 Trypan 蓝色的可行性单元格数，并确定单元格数和生存百分比。在此之后，将电池悬浮液在400倍g下离心5分钟。

以完整的 IMDM 重新补充细胞，以每毫升 1000 万个细胞的密度稀释鸡 CD40 配体。培养96或24孔板中的细胞48至72小时。隔离后48至72小时，解冻病毒的等分。

漩涡样品，并储存在冰上。在 IMDM 介质中重新发送主毛刺细胞。服用10微升的细胞悬浮液，并将其添加到 Trypan 蓝色溶液的10微升。

然后，确定细胞的数量和百分比的生存能力。将病毒在1X中稀释完成 IMDM 以适当的多重感染，使病毒进一步产生。通过涡旋混合这种稀释。

将电池悬浮液以400倍g离心5分钟。接下来，取出上流液，重新暂停病毒中细胞的孵化。在37摄氏度下孵育一小时，定期搅拌。

在此之后，将电池悬浮液在400倍g下离心5分钟。去除病毒，用1X完整的 IMDM 介质清洗细胞。培养96或24孔板中的细胞。

在这项研究中，鸡原生毛刺细胞在可溶性鸡CD40配体的存在下连续培养出体。在可溶性鸡CD40配体存在的情况下培养的细胞在6天内每毫升90.2万个，增加四倍，从90.2万份到363万。在存在鸡肉CD40配体的情况下，细胞的生存能力也显著提高。

在代表性的共生显微镜图像中，受感染的细胞在细胞核周围出现绿色荧光，这与细胞质中IBDV的存在是一致的。这对于两个IBDV菌株来说是显而易见的，一种是细胞培养适应菌株，D78，一种是非常致命的菌株，UK661。然后在感染后5、18、24和48小时内提取RNA，并接受RT-qPCR的底向剂，该底土特定于IBDV VP4基因的保守区域。

IBDV VP4表达在感染D78后48小时增加至16，603份，感染后48小时增加38，632份，感染后48小时为38，632份， 感染后与 UK661。这些数据表明，鸡原生毛刺细胞可以支持细胞培养适应和非常致命的IBDV菌株的复制。按照这个程序，可以执行其他方法，如RT-qPCR，微阵列，或RNA-Seq，以回答其他问题，如细胞如何回应感染。

我们已经比较了细胞如何反应感染与衰减菌株和非常致命的株IBDV和我们现在调查他们如何回应其他病毒感染。培养这些细胞的能力使我们能够研究病毒发病机制和免疫抑制方面，而无需感染鸟类。这将对三个R产生重大影响，即动物在研究中的替换、改进和减少使用。