Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области птичьей вирусологии, такие как, как иммуносупрессивные вирусы взаимодействуют с клетками В. Основным преимуществом этого метода является то, что клетки более актуальны, чем увековеченные клеточные линии, используемые в настоящее время в лаборатории. Хотя этот метод дает представление о том, как куриные клетки реагируют на IBDV, он также может быть применен к ALV и REV.
Этот метод уменьшает количество птиц в наших исследованиях, и это выгодно для трех Rs, который выступает за замену, сокращение и уточнение использования животных в исследованиях. В микробиологическом шкафу безопасности, мыть BF в 30 миллилитров холодного PBS по крайней мере три раза. Перенесите промытую ткань в чашку Петри и добавьте пять миллилитров раствора коллагеназы D 1X.
Используйте стерильные ножницы или лезвие скальпеля, чтобы разрезать BF на куски диаметром менее пяти миллиметров. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию с периодическим нежным возбуждением в течение 30 минут. После этого используйте стерильную пипетку Pasteur, чтобы неоднократно аспирировать смесь, чтобы стимулировать распад ткани.
Добавьте в ткань еще пять миллилитров раствора коллагеназы D 1X и инкубировать его при 37 градусах Цельсия с периодическим нежным возбуждением еще 30 минут. Повторите этот процесс, аспирируя смесь, добавляя свежий раствор коллагеназы D и инкубации до тех пор, пока ткань полностью не переваривается. Обратите внимание, что будут небольшие гранулы, которые не растворятся дальше.
Перейдите усваиваемую клеточную подвеску через 100-микрон-клеточный ситечко в 20 миллилитров 1X HBBS без кальция. Центрифуга по 400 раз г в течение пяти минут. Отбросьте супернатант, повторно посовещенные гранулы в 10 миллилитров 1X RPMI с 5%FBS.
Затем наложить 10 миллилитров клеточной суспензии поверх пяти миллилитров градиентных средств плотности, которые содержат полисуцоз и диатризоат натрия. Убедитесь, что между двумя слоями существует четкий интерфейс. Центрифуга при 900 раз г и четыре градуса по Цельсию в течение 20 минут.
Клетки должны образовывать полосу на стыке между клеточным мультимедиа и градиентом плотности. Затем используйте стерильную пипетку Pasteur, чтобы удалить клетки и перенести их в трубку, содержащую холодный PBS. Вымойте клетки, центрифугировать их при 400 раз g в течение пяти минут, а затем повторно их в холодном PBS.
Повторите эту стирку три раза. Во-первых, центрифуга клеточной суспензии при 400 раз g в течение пяти минут. Resuspend клетки в 30 миллилитров 1X полный IMDM.
Возьмите aliquot подвески клетки, и добавить его в Trypan синий раствор. Подсчитайте количество жизнеспособных ячеек, исключающие синий Трипан, и определите количество ячеек и процент жизнеспособности. После этого центрифугировать подвесную клетку при 400 раз г в течение пяти минут.
Переусердовать клетки в полном IMDM дополняется от одного до 20 разбавления куриный CD40 лиганд при плотности 10 миллионов клеток на миллилитр. Культура клеток в 96-или 24-хорошо пластин в течение 48 до 72 часов. От 48 до 72 часов после изоляции, оттепель aliquot вируса.
Вихрь образца, и хранить его на льду. Повторное высасывка первичных бурсал-клеток в среде IMDM. Возьмите 10-микролитер aliquot клеточной подвески, и добавить его в 10 микролитров trypan синий раствор.
Затем определите количество ячеек и процентную жизнеспособность. Разбавить вирус в 1X полный IMDM к соответствующему множественности инфекции, чтобы сделать вирус inoculum. Смешайте это разбавление вихрем.
Центрифуга клеточной суспензии при 400 раз г в течение пяти минут. Далее удалите супернатант и повторно помеская клетки в инокуле вируса. Инкубировать при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа с периодическим возбуждением.
После этого центрифугировать подвесную клетку при 400 раз г в течение пяти минут. Удалите вирус inoculum, и мыть клетки в 1X полный IMDM средств массовой информации. Культура клеток в 96-или 24-хорошо пластин.
В этом исследовании, курица первичных бурсал клеток последовательно культурных ex vivo в присутствии растворимой курицы CD40 лиганд. Клетки, культурные в присутствии растворимой курицы CD40 лиганда, как представляется, увеличится в четыре раза с 902000 до 3,63 миллиона на миллилитр в течение шести дней. Жизнеспособность клеток также значительно повышается при наличии куриного лиганда CD40.
На репрезентативных изображениях конфокальные микроскопии инфицированные клетки имеют зеленую флуоресценцию вокруг ядра, что согласуется с наличием МБДВ в цитоплазме. Это очевидно для двух штаммов IBDV, клеточной культуры адаптированного штамма, D78, и очень вирулентного штамма, UK661. РНК затем извлекается в пять, 18, 24 и 48 часов после заражения и подвергается RT-qPCR с грунтовки, характерные для сохраненной области гена IBDV VP4.
IBDV VP4 выражение, как видно, увеличится до 16, 603 копий в 48 часов после заражения D78 и до 38, 632 экземпляров в 48 часов после заражения UK661. Эти данные показывают, что куриные первичные бурсальные клетки могут поддерживать репликацию клеток-культуры адаптированных и очень вирулентных штаммов IBDV. После этой процедуры, другие методы, такие как RT-qPCR, microarray, или РНК-Seq могут быть выполнены для того, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как клетки реагируют на инфекцию.
Мы сравнили, как клетки реагируют на инфекцию с затухаем штаммом и очень вирулентным штаммом IBDV и наши теперь расследование, как они реагируют на другие вирусные инфекции. Способность к культуре этих клеток позволяет нам изучать аспекты патогенеза вируса и иммуносупрессии без необходимости инфицировать птиц. Это будет иметь существенное влияние на три Rs, замена, уточнение, и сокращение использования животных в исследованиях.
