이 방법은 면역 억제 바이러스가 B 세포와 상호 작용하는 방법과 같은 조류 바이러스 학 분야의 주요 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있습니다. 이 기술의 주요 장점은 세포가 현재 실험실에서 사용되는 불멸의 세포주보다 더 관련이 있다는 것입니다. 이 방법은 닭 세포가 IBDV에 어떻게 반응하는지에 대한 통찰력을 제공하지만 ALV 및 REV에도 적용 할 수 있습니다.
이 방법은 우리의 연구에서 조류의 수를 감소, 그것은 연구에서 동물의 사용의 교체, 감소 및 정제를 의미 하는 세 Rs에 도움이. 미생물 안전 캐비닛에서 BF를 30 밀리리터의 감기 PBS로 적어도 세 번 세척하십시오. 세척된 조직을 페트리 접시에 옮기고 1X 콜라게나아제 D 용액의 5밀리리터를 추가합니다.
멸균 가위 나 메스 블레이드를 사용하여 BF를 직경 5 밀리미터 미만의 조각으로 자른다. 섭씨 37도에서 30분 동안 주기적인 부드러운 동요를 통해 배양하세요. 그 후, 멸균 파스퇴르 파이펫을 사용하여 혼합물을 반복적으로 흡인하여 조직의 붕괴를 장려합니다.
조직에 1X 콜라게나아제 D 용액의 5밀리리터를 추가하고, 37°C에서 주기적인 부드러운 동요로 30분간 배양합니다. 이 과정을 반복하여 혼합물을 흡수하고 신선한 콜라게나아제 D 용액을 추가하고 조직이 완전히 소화될 때까지 배양합니다. 더 이상 용해되지 않는 작은 과립이 있을 것입니다.
소화된 세포 현탁액을 100미크론 세포 여과기를 칼슘 없이 1X HBBS의 20밀리리터로 전달합니다. 원심 분리기는 5 분 동안 400 배 g에서. 상체를 버리고 펠릿을 10 밀리리터의 10 밀리리터에서 5%의 FBS로 재보페합니다.
그런 다음, 다당류와 디아트리조아테를 포함하는 밀도 그라데이션 미디어의 5밀리리터 위에 세포 현탁액의 10 밀리리터를 오버레이. 두 레이어 사이에 명확한 인터페이스가 있는지 확인합니다. 원심분리기는 900g, 섭씨 4도에서 20분 간.
셀은 세포 미디어와 밀도 그라데이션 미디어 사이의 인터페이스에서 대역을 형성해야 합니다. 다음으로, 멸균 파스퇴르 파이펫을 사용하여 세포를 제거하고 차가운 PBS를 포함하는 튜브로 옮춥시다. 세포를 원심분리하여 5분 동안 400회 g로 씻어낸 다음 차가운 PBS에서 다시 분리합니다.
이 세척을 세 번 반복합니다. 먼저, 5분 동안 세포 현탁액을 400배 g로 원심분리합니다. 1X 완전 IMDM의 30 밀리리터에서 세포를 다시 중단합니다.
셀 서스펜션의 알리쿼트를 가져 와서 Trypan 파란색 용액에 추가하십시오. Trypan 청을 제외한 실행 가능한 셀 수를 계산하고 셀 수와 백분율 생존가능성을 결정합니다. 그 후, 5분 동안 세포 현탁액을 400배 g로 원심분리합니다.
밀리리터당 1,000만 개의 세포밀도로 닭고기 CD40 리간드의 1-20 희석으로 보충된 완전한 IMDM에서 세포를 재중단합니다. 48~72시간 동안 96-또는 24웰 플레이트에서 세포를 배양한다. 48 ~ 72 시간 후 격리, 바이러스의 알리쿼시를 해동.
샘플을 소용돌이치게 하고 얼음 위에 보관하십시오. IMDM 배지에서 1차 활액 세포를 다시 중단합니다. 셀 서스펜션의 10 마이크로리터 알리쿼트(aliquot)를 사용하여 Trypan blue 용액의 10마이크로리터에 추가합니다.
그런 다음 셀 수와 백분율 생존가능성을 결정합니다. 바이러스를 접종할 수 있도록 적절한 복합감염으로 1X 완전 IMDM으로 바이러스를 희석시. 이 희석을 소용돌이에 섞습니다.
5 분 동안 400 배 g에서 세포 현탁액을 원심 분리합니다. 다음으로, 상체를 제거하고 바이러스 접종에서 세포를 다시 중단합니다. 주기적인 동요로 1시간 동안 섭씨 37도에서 배양합니다.
그 후, 5분 동안 세포 현탁액을 400배 g로 원심분리합니다. 바이러스 접종을 제거하고 1X 완전한 IMDM 매체로 세포를 세척한다. 96-또는 24웰 플레이트중 하나에서 세포를 배양합니다.
이 연구에서, 닭 원발성 bursal 세포는 수용성 닭 CD40 리간드의 존재에 연속적으로 배양 ex vivo. 수용성 닭 CD40 리간드의 존재에서 배양된 세포는 6일 동안 밀리리터당 902, 000에서 363만 으로 4배 증가하는 것으로 여겨진다. 닭 CD40 리간드의 존재에서 세포 생존도 크게 향상됩니다.
대표적인 공초점 현미경 심상에서, 감염된 세포는 세포질에 있는 IBDV의 존재와 일치하는 핵의 주위에 녹색 형광이 있는 것을 보입니다. 이것은 IBDV의 2개의 긴장, 세포 배양 적응한 긴장, D78 및 아주 악성 긴장, UK661를 위해 분명합니다. RNA는 감염 후 5, 18, 24 및 48시간에서 추출되고 IBDV VP4 유전자의 보존 된 영역에 특정 된 프라이머를 가진 RT-qPCR을 실시한다.
IBDV VP4 발현은 D78을 감염한 후 48시간 동안 16, 603부, UK661로 48시간 후소시로 38개, 632부로 증가한다. 이 데이터는 닭 1 차 적인 bursal 세포세포가 세포 배양 적응하고 아주 악성 IBDV 긴장의 복제를 지원할 수 있다는 것을 보여줍니다. 이 절차에 따라 RT-qPCR, 마이크로어레이 또는 RNA-Seq와 같은 다른 방법은 세포가 감염에 어떻게 반응하는지와 같은 추가 질문에 대답하기 위해 수행 될 수 있습니다.
우리는 세포가 감쇠된 긴장및 IBDV의 아주 악성 긴장으로 감염에 어떻게 반응하는지 비교하고 우리의 지금 그(것)들이 그밖 바이러스성 감염에 어떻게 반응하는지 조사하고 있습니다. 이 세포를 배양하는 기능은 우리가 조류를 감염시킬 필요 없이 바이러스 병인및 면역 억제의 양상을 연구할 수 있습니다. 이것은 연구에서 동물의 사용의 교체, 정제 및 감소세 Rs에 상당한 영향을 미칠 것입니다.
