Bu yöntem, immünsupresif virüslerin B hücreleriile nasıl etkileşime girdiği gibi kuş virolojialanındaki temel soruların yanıtlanmasına yardımcı olabilir. Bu tekniğin en büyük avantajı, hücrelerin şu anda laboratuvarda kullanılan ölümsüzleştirilmiş hücre hatlarından daha alakalı olmasıdır. Bu yöntem tavuk hücrelerinin IBDV'ye nasıl tepki verdiğine dair içgörü sağlasa da, ALV ve REV'ye de uygulanabilir.
Bu yöntem, araştırmamızdaki kuş sayısını azaltır ve araştırmada hayvan kullanımının değiştirilmesi, azaltılması ve iyileştirilmesi anlamına gelen üç Rs için yararlıdır. Mikrobiyolojik güvenlik kabininde BF'yi en az üç kez 30 mililitre soğuk PBS ile yıkayın. Yıkanmış dokuyu Petri kabına aktarın ve beş mililitre 1X kollajenaz D çözeltisi ekleyin.
BF'yi çapı beş milimetreden daha az olan parçalara dönüştürmek için steril makas veya neşter bıçağı kullanın. 30 dakika boyunca periyodik nazik ajitasyon ile 37 santigrat derecede kuluçka. Bundan sonra, doku parçalanmasını teşvik etmek için tekrar tekrar karışımı aspire steril bir Pasteur pipet kullanın.
Dokuya 1X kollajenaz D çözeltisi başka bir beş mililitre ekleyin ve başka bir 30 dakika boyunca periyodik nazik ajitasyon ile 37 santigrat derece kuluçka. Bu işlemi tekrarlayın, karışımı aspire, taze kollajenaz D çözeltisi ekleyerek, ve doku tamamen sindirilir kadar kuluçka. Daha fazla çözünmeyecek küçük granüller olacağını unutmayın.
Sindirilmiş hücre süspansiyonundan 100 mikronluk bir hücre süzgecinden kalsiyumsuz 1X HBBS'nin 20 mililitresine geçirin. Santrifüj 400 kez g beş dakika için. Supernatant atın, 5% FBS ile 1X RPMI 10 mililitre pelet resuspend.
Daha sonra, polisökroz ve sodyum diatrizoat içeren yoğunluk gradyan medya beş mililitre üstüne hücre süspansiyon 10 mililitre bindirme. İki katman arasında açık bir arabirim olduğundan emin olun. Santrifüj 900 kez g ve 4 santigrat derece 20 dakika.
Hücreler hücre ortamı ve yoğunluk gradyan ortam arasındaki arabirimde bir bant oluşturmalıdır. Daha sonra, hücreleri kaldırmak ve soğuk PBS içeren bir tüp e nakletmek için steril bir Pasteur pipet kullanın. Hücreleri 400 kez g'de beş dakika santrifüj ederek yıkayın ve soğuk PBS'de yeniden sulandırın.
Bu yıkamayı üç kez tekrarlayın. İlk olarak, hücre süspansiyonuna 400 kez g'de beş dakika santrifüj edin. 1X tam IMDM 30 mililitre hücreleri resuspend.
Hücre süspansiyonundan bir aliquot alın ve trypan mavisi bir solüsyona ekleyin. Trypan mavisini dışlayan canlı hücrelerin sayısını sayın ve hücre sayısını ve yüzde canlılığını belirleyin. Bundan sonra, hücre süspansiyonuna 400 kez g'de beş dakika santrifüj edin.
Mililitre başına 10 milyon hücre yoğunluğunda tavuk CD40 ligand bir-20 seyreltme ile desteklenen tam IMDM hücreleri resuspend. Kültür 48 ila 72 saat boyunca 96 veya 24-iyi plakalar hücreleri. 48 ila 72 saat sonra izolasyon, virüsün bir aliquot çözülme.
Örneği girdap ve buzda saklayın. IMDM ortamındaki birincil bursal hücrelerini yeniden askıya alın. Hücre süspansiyonunun 10 mikrolitrelik aliquot'unu alın ve 10 mikrolitrelik Trypan mavisi çözeltisine ekleyin.
Daha sonra, hücre sayısını ve yüzde canlılığını belirleyin. Virüsü 1X tam IMDM içinde virüs inoculum yapmak için enfeksiyon uygun çokluğu seyreltin. Girdap ile bu seyreltme karıştırın.
Hücre süspansiyonuna 400 kez g.'yi beş dakika lığına santrifüj edin. Sonra, supernatant çıkarın ve virüs inoculum hücreleri resuspend. 37 derecede periyodik ajitasyonla bir saat kuluçkaya yat.
Bundan sonra, hücre süspansiyonuna 400 kez g'de beş dakika santrifüj edin. Virüs inoculum kaldırın ve 1X tam IMDM ortamda hücreleri yıkayın. Kültür ya 96-veya 24-iyi plakalar hücreleri.
Bu çalışmada, tavuk birincil bursal hücreleri çözünür tavuk CD40 ligand varlığında art arda kültürlü ex vivo vardır. Çözünür tavuk CD40 ligand varlığında kültürhücreleri altı günlük bir süre içinde 902, 000 000 milyon mililitre başına dört kat artış görülmektedir. Hücre canlılığı da önemli ölçüde tavuk CD40 ligand varlığında geliştirilmiştir.
Temsili konfokal mikroskopi görüntülerinde, enfekte hücrelerin çekirdeğin etrafında yeşil floresan olduğu görülmektedir, bu da sitoplazmada IBDV varlığı ile tutarlıdır. Bu IBDV iki suşları için açıktır, bir hücre kültürü uyarlanmış suşu, D78, ve çok öldürücü bir gerginlik, UK661. RNA daha sonra beş, 18, 24 ve 48 saat sonra enfeksiyon sonrası çıkarılır ve IBDV VP4 geninin korunmuş bölgesine özgü astarlarla RT-qPCR'ye tabi tutulur.
IBDV VP4 ekspresyonu, D78 ile enfeksiyon sonrası 48 saat, UK661 ile 48 saat postenfeksiyon da 632 kopya da 16, 603 kopyaya yükselmektedir. Bu veriler tavuk birincil bursal hücrelerinin hücre kültürü-uyarlanmış ve çok öldürücü IBDV suşlarının replikasyon destekleyebilir göstermektedir. Bu yordamı takiben, rt-qPCR, mikrodizi veya RNA-Seq gibi diğer yöntemler hücrelerin enfeksiyona nasıl tepki gibi ek soruları yanıtlamak için gerçekleştirilebilir.
Biz hücrelerin zayıflatılmış bir suşu ve IBDV çok öldürücü bir suş ile enfeksiyona nasıl tepki ve şimdi diğer viral enfeksiyonlara nasıl tepki araştırdıklarını karşılaştırdık. Bu hücreleri kültüre yeteneği bize kuşlara bulaştırmak gerek kalmadan virüs patogenezi ve immünsupresyon yönlerini çalışma sağlar. Bu üç Rs üzerinde önemli bir etkisi olacak, değiştirme, arıtma, ve araştırma hayvanların kullanımının azaltılması.
